Cd антигенные маркеры в онкогематологии. Маркеры и рецепторы иммунокомпетентных клеток

Т-лимфоцит ы (Т-клетки ) выполняют различные функции, в связи с чем их подразделяют на субпопуляции. Т-клетки распознают Аг, в том числе переработанные Аг-представляющими клетками, обеспечивают реализацию клеточных иммунных реакций. Кроме того, Т-лимфоциты взаимодействуют с В-лимфоцитами в ходе выработки последними гуморальных иммунных реакций. Активация Т-клеток происходит под действием макрофагов.

Созревание Т-клеток

Предшественники Т-клеток (тимоциты) созревают в вилочковой железе. Их дифференцировку регулируют взаимодействия с эпителиальными и дендритными клетками стромы тимуса, а также гормоноподобные полипептидные факторы эпителиальных клеток тимуса (например, тимозины, тимопоэтины).

Маркёры Т-клеток

Т-клетки обладают маркёрами - специфическими поверхностными белковыми молекулами, присущими тем или иным субпопуляциям этих клеток.

CD-маркёры Т-лимфоцитов.

При дифференцировке Т-лимфоцитов на их плазмолемме появляются специфические Аг, выступающие в роли маркёров. Эти так называемые «кластеры дифференцировк и» - CD-маркёры [от англ. cluster of differentiation] - указывают на функциональные способности лимфоцитов и некоторых других клеток. CD-маркёры идентифицируют с помощью моноклональных AT. После выхода зрелых клеток из тимуса они экспрессируют CD4 или CD8, а также CD3. При некоторых иммунодефицитах обнаруживают нарушения нормального содержания клеток с тем или иным маркёром (например, СD4+-клеток при СПИДе). Т-клетки подразделяют на субпопуляции в соответствии с их функцией и профилем мембранных маркёров, в частности CD-Aг.

Номенклатура

Номенклатура была предложена на 1-й Международной конференции по антигенам дифференцировки лейкоцитов человека (Париж , ). Система создана для упорядочивания большого количества моноклональных антител к эпитопам на поверхности лейкоцитов, полученных в лабораториях во всём мире. Таким образом, определённый CD-антиген приписывается к группе моноклональных антител (необходимо наличие, по крайней мере, двух различных клонов), которые распознают один и тот же эпитоп на поверхности клетки. CD-антигеном также называют и непосредственно сам белок -маркер, с которым реагируют данные антитела. Следует отметить, что данная номенклатура классифицирует кластеры безотносительно клеточной функции белка. Нумерация идёт в хронологическом порядке от ранее описанных антигенов к более поздним.

В настоящее время данная классификация значительно расширена и включает не только лейкоциты , но и другие типы клеток . Более того, многие CD-антигены являются не поверхностными, а внутриклеточными белками-маркерами. Некоторые из них являются не белками, а поверхностными углеводами (например, CD15). Насчитывается более 320 антигенов и их подтипов.

Иммунофенотипирование

Система кластеров дифференцировки применяется в иммунофенотипировании для отнесения клеток к тому или иному типу по представленным на клеточных мембранах молекулам-маркёрам. Наличие определённых молекул может быть ассоциировано с соответствующими иммунными функциями. Хотя наличие одного типа CD обычно не позволяет точно определить популяцию клетки (за исключением нескольких примеров), сочетания маркёров позволяют определить её достаточно чётко.

СD -молекулы, используемые для сортировки клеток в различных методах, таких как проточная цитометрия .

Два наиболее широко используемых CD -маркера - CD4 и CD8 , которые соответственно являются характерными для T-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов . Эти молекулы определяются в сочетании с CD3+, так и с другими маркерами для других популяций клеток (некоторые макрофаги экспрессируют низкие уровни CD4;

Весьма часто в клинической практике возникает подозрение на острый лейкоз. Наличие высокого процента бластных клеток в костном мозге позволяет верифицировать этот диагноз. Морфоцитохимическое исследование, как правило, проводится на том же материале и в те же сроки, что и иммунофенотипирование. Иначе говоря, на момент проведения иммунофенотипирования вариант острого лейкоза (лимфоидный или миелоидный), а тем более линейная принадлежность бластных клеток при лимфобластных лейкозах неизвестны. Поэтому на первом этапе иммунодиагностики задача состоит в определении линейной принадлежности острого лейкоза, с тем чтобы далее уточнить стадию зрелости и подвариант заболевания.

Алгоритм скрининга острого лейкоза включает всего лишь одну пробу с 8 антителами различной специфичности. Это позволяет в 98,3% случаев правильно диагностировать острый лейкоз, его вариант и линейную принадлежность клеток острого лимфобластного лейкоза.

Используются антитела CD45 для идентификации бластов (клеток-предшественников), три наиболее надежных цитоплазматических маркера линейной принадлежности - CD3 (для Т-клеток), CD79a (для В-клеток), МРО (для миелоидных клеток), мембранные маркеры Т-клеток (CD3, CD7) и В-лимфоцитов (CD19), а также стволовоклеточный антиген CD34. Наиболее специфичным цито-плазматическим маркером В-клеток принят CD79a, а не традиционно используемый CD22. Это обусловлено тем, что cyCD22 не является линиеспецифичным для В-клеток, так как сильно экспрессирован на нормальных базофилах, тучных клетках и плазмоцитоидных дендритных клетках. При выборе маркеров клеток-предшественников предпочтителен CD34, а не TdT. Это обусловлено тем, что CD34 экспрессирован на незрелых клетках всех линий. В зависимости от полученных данных используются наборы антител для иммунодиагностики В-линейных острых лейкозов, Т-линейных острых лейкозов и острого миелобластного лейкоза.

Целью иммунодиагностики В-ОЛЛ является распознавание и классификация всех опухолей из незрелых В-клеток.

Иммунофенотипически В-ОЛЛ напоминают нормальные В-линейные предшественники, остановленные в своем развитии на различных стадиях созревания. Вместе с тем экспрессия целого ряда антигенов на клетках В-ОЛЛ существенно отличается от нормы, являясь асинхронной, эктопической или аберрантной. Информация об аберрантности клеток В-ОЛЛ при диагностике является важной для последующего мониторинга минимальной остаточной болезни. Необходимы идентификация нормальных В-линейных предшественников, определение их иммунофенотипических отличий от нормальных и регенерирующих клеток, установление уровня блока созревания. Важными составляющими иммунодиагностического процесса являются выявление лейкозных иммунофенотипов для последующей оценки уровня минимальной остаточной болезни, а также определение иммунофенотипических профилей, ассоциированных с повторяющимися онкогенными аномалиями. Эта информация важна для оценки прогноза у больных.

Для точной идентификации В-бластов используются повторяющиеся в пробах («каркасные») маркеры: общелейкоцитарный антиген CD45, стволовоклеточный антиген CD34 и В-линейный антиген CD19.

CD45 использован для гейтинга бластов и исключения из анализа зрелых В-клеток. Идентифицировать все В-клетки в изучаемом образце крови или костного мозга позволяет CD19, так как он экспрессирован на В-линейных предшественниках и практически во всех случаях В-ОЛЛ. CD34 - маркер незрелости, который не является линейно-ассоциированным и часто (но не всегда) экспрессирован при В-ОЛЛ. Экспрессия CD34 не столь хорошо коррелирует с В-клеточной дифференцировкой, как CD10. CD34 наилучшим образом отражает внутриклональную гетерогенность злокачественных В-линейных предшественников.

Помимо каркасных антител, в панели В-ОЛЛ включены маркеры для дифференциальной диагностики этой подгруппы лейкозов, позволяющие подтвердить принадлежность бластных клеток к предшественникам В-линии, исключить смешанно-линейный лейкоз, представить доказательства злокачественности, то есть опухолевой природы анализируемых клеток. Подобными доказательствами при анализе незрелых В-лимфоидных клеток являются асинхронная экспрессия антигенов (например, коэкспрессия CD20hi и CD34hi), аберрантная или эктопическая экспрессия антигенов (например, CD33hi), исчезновение нормальной кинетики иммунофенотипического созревания В-линейных предшественников.

По этим причинам в диагностический алгоритм В-ОЛЛ включены маркеры, ассоциированные с В-линией (CD22, CD24, CD10, CD20, cyIg, SmIg), маркеры для дифференциальной диагностики с другими острыми лейкозами (CD13, CD33, CD117, CD15, CD65 - для исключения острого миелобластного лейкоза), а также другие антигены, полезные для разграничения от нормальных образцов В-линейной дифференцировки (nuTdT, CD10, CD38, CD20, CD123).

Антиген CD22 является одним из наиболее информативных В-линейно ассоциированных антигенов. Однако он не является специфичным для В-клеток, так как экспрессирован на базофилах, тучных клетках и плазмоцитоидных дендритных клетках. В пределах лимфоидной линии экспрессия этого антигена указывает на В-клеточную природу, причем антиген появляется на самых ранних стадиях дифференцировки В-линейных предшественников. Сходным образом CD24 экспрессирован так же, начиная с самых ранних стадий дифференцировки В-клеток, однако, помимо В-клеток, присутствует на гранулоцитах.

Миелоидные антигены (CD13, CD33, CD117, CD15, CD65) включены в панель для определения CD19-позитивных острых миелобластных лейкозов, которые могли быть пропущены на этапе скрининга острого лейкоза. При проведении иммунодиагностики В-ОЛЛ важно учитывать взаимоисключающий или взаимодополняющий характер экспрессии ряда маркеров. Так, например, SmIgμ не может быть экспрессирован на В-линейных предшественниках независимо от CyIgμ. Напротив, рецептор CD117 практически никогда не обнаруживается при В-ОЛЛ. Поэтому антитела к этим двум маркерам можно объединить в одной пробе и получить ответ - SmIgμ+ CD117)+. При отсутствии СyIgμ подобные наблюдения следует трактовать как позитивные по CD117. Маркеры CD15 и CD65 объединены в одной пробе по иной причине - информация, которую они дают при В-ОЛЛ, является сходной и перекрывающейся.

В тех случаях, когда нормальные незрелые, регенерирующие лимфоидные клетки (гематогонии) выявляются в мазках костного мозга на морфологическом уровне, возникает вопрос об их разграничении от злокачественных клеток В-ОЛЛ. Регенерирующие клетки характеризуются гетерогенными образцами окрашивания в силу присутствия нескольких стадий дифференцировки с последовательной и скоординированной экспрессией множества антигенов, а лейкозные популяции являются значительно более однородными. Поскольку нормальное созревание В-линейных предшественников характеризуется снижением экспрессии CD10 и CD38 и нарастанием экспрессии CD20, эти три маркера оцениваются одновременно. Ядерная TdT(NuTdT) является маркером незрелости, который экспрессирован главным образом в Ти В-лимфоидных предшественниках, но вместе с тем определяется в 25% случаев острого миелобластного лейкоза. Этот маркер лишен линейной специфичности, он позволяет идентифицировать незрелых предшественников и в случаях асинхронности экспрессии может служить подтверждением злокачественной природы клеток.

Стадии созревания клеток В-ОЛЛ обычно определяются на основании CD10, CyIgμ, SmIgM, CyIgK и CyIgλ. В классификации ВОЗ выделяют про-В, общий (common) и пре-В иммуноподварианты В-ОЛЛ. В российской литературе вместо термина «общий» используется эквивалент наименования соответствующей стадии дифференцировки - препре-В-ОЛЛ.

Аберрантная экспрессия ряда антигенов при В-ОЛЛ взаимосвязана со специфическими повторяющимися молекулярно-генетическими аномалиями. Так, BCR-ABL-позитивные В-ОЛЛ характеризуются, как правило, экспрессией миелоидных маркеров CD13 и CD33 в сочетании с CD34hi и CD38lo при отсутствии на мембране клеток антигена CD117. Кроме того, при обнаружении гена слияния BCR-ABL при В-ОЛЛ нередко наблюдается экспрессия CD66c. Лейкозы с реаранжировкой MLL обычно имеют иммунофенотип CD19+CD34+NuTdT+CD10- CD15±CD65±CD9+CD24-/частично+ с наличием характерной (но неспецифичной) экспрессии NG2. В-ОЛЛ с наличием TEL-AML1 наряду с типичным иммунофенотипом В-линейных предшественников характеризуются отсутствием CD9 и CD66c. Напротив, при В-ОЛЛ с реаранжировкой гена Е2А-РВХ1 фенотип пре-В клеток сочетается с выраженной экспрессией CD9.Оценка минимальной резидуальной болезни методом проточной цитометрии заняла прочное место в мониторинге эффективности лечения В-ОЛЛ. Маркеры, позволяющие разграничить злокачественные клетки В-ОЛЛ от регенерирующих В-линейных предшественников, могут с успехом использоваться в определении минимальной резидуальной болезни. Дополнительную информацию дают CD123, CD21, CD81 и CD58.

Несмотря на то что CD123 является главным маркером ЛИ, его экспрессия на бластах не является стабильной. Роль CD21 в определении аберрантности заключается в том, что он может быть экспрессирован на CD19+CD34+ злокачественных В-клетках, но отсутствует на нормальных В-линейных предшественниках. Молекула тетраспанина CD81 сильно экспрессирована на нормальных В-линейных предшественниках, но крайне слабо представлена в большинстве случаев (>80%) В-ОЛЛ. Особую роль в определении лейкозных иммунофенотипов играет молекула CD58, которая очень часто гиперэкспрессирована на бластных клетках В-ОЛЛ в сравнении с регенерирующими нормальными предшественниками В-клеток (например, гематогониями).

Иммунодиагностика острого лимфобластного лейкоза из Т-клеточных предшественников
Т-ОЛЛ - это гетерогенная группа злокачественных заболеваний, определяемая на основании размножения незрелых Т-клеточных предшественников, блокированных на определенных стадиях созревания, обычно отличающихся от нормальных образцов Т-клеточной дифференцировки.

Одной из главных задач в иммунодиагностике Т-ОЛЛ является обнаружение в крови или костном мозге больных незрелых Т-клеток. В норме Т-клеточное развитие происходит главным образом в тимусе, и обнаружение незрелых Т-клеток в периферической крови, костном мозге или тканях, иных, нежели тимус, уже само по себе аномально и часто достаточно для диагностики. Исключение составляют медиастинальные опухоли, при диагностике которых необходимо отличать нормальные тимоциты от злокачественных. Более того, необходима субклассификация Т-ОЛЛ в соответствии со стадиями дифференцировки клеток Т-линии и основными генетическими подгруппами. Большое количество соматических генетических маркеров вносят вклад в онкогенез Т-ОЛЛ. Некоторые из них сосуществуют (например, NUP214-ABL1 и гиперэкспрессия TLX1/TLX3) и могут встречаться в субклонах Т-ОЛЛ.

В сравнении с В-ОЛЛ и ОМЛ при Т-ОЛЛ установлено сравнительно малое число иммунофенотипических профилей, взаимосвязанных с повторяющимися молекулярными аномалиями. В их числе частая, хотя и не постоянная и не являющаяся специфичной, перестройка CALM-AF10 при CD2-негативных вариантах Т-ОЛЛ, которые могут быть TCRγδ+. Напротив, значительное количество молекулярных аномалий при Т-ОЛЛ ассоциированы с типичным блоком созревания Т-клеток и профилями генной экспрессии. Примером является сочетание гиперэкспрессии TLX1 с иммунофенотипом кортикальных тимоцитов. Несмотря на фенотипическое сходство между Т-ОЛЛ и нормальным тимическим созреванием, детальное многопараметровое иммунофенотипирование позволяет идентифицировать образцы белковой экспрессии, которые отличают Т-ОЛЛ от нормальных тимических аналогов.

В качестве каркасных маркеров в панели Т-ОЛЛ используются CD45, а также цитоплазматические и мембранные CD3. Сочетание этих маркеров позволяет легко идентифицировать бластные клетки и отграничить Т-клеточные предшественники от зрелых Т-лимфоцитов. Для этих целей не подходят весьма распространенные маркеры Т-ОЛЛ, такие как CD99, CD5 и CD7. Экспрессия CD99 наблюдается не при всех вариантах Т-ОЛЛ, может отсутствовать при более зрелых Т-ОЛЛ, кроме того, окрашивание этими антителами весьма слабое для отграничения бластных клеток от резидуальных нормальных Т-лимфоцитов. Антиген CD5 обычно экспрессирован при Т-ОЛЛ, но может быть слабым и негативным, в особенности на подклассе незрелых Т-ОЛЛ. CD7 экспрессирован практически во всех случаях, но не является линиеспецифичным.

Для установления стадии дифференцировки и дополнительного подтверждения Т-клеточной природы используются маркеры CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD99, TCRαβ, TCRγδ. Происхождение Т-ОЛЛ из предшественников подтверждают наличие TdT, CD1a, CD34 и CD99.

Маркеры миелоидной линии (CD13, CD33, CD117) экспрессированы главным образом при Т-ОЛЛ из ранних Т-клеточных предшественников. Большие сложности представляет дифференциальная диагностика Т-ОЛЛ с так называемыми лимфобластными лейкозами/лимфомами из NK-клеточных предшественников. Использование CD56 может помочь в диагностике в подобных редких случаях. Вместе с тем разграничение NK-ОЛЛ и незрелых Т-ОЛЛ может быть сложным, так как по определению Т-ОЛЛ и в особенности незрелые случаи могут экспресси-ровать CD56. Являются ли эти лейкозы различными нозологическими единицами, остается неясным. Важно отметить, что Т-клеточные антигены, такие как CD2, CD7 и даже CD5 и cyCD3, могут быть экс-прессированы при NK-ОЛЛ. Обнаружение миелоид-ных антигенов может быть полезным в диагностике незрелых Т-ОЛЛ в подобных ситуациях. Лейкозы из плазмоцитоидных дендритных клеток также могут экспрессировать Т-клеточные антигены (например, CD2, CD7). Помочь в дифференциальной диагностике могут cyCD3, CD4, CD123, и CD56, в меньшей степени - HLA-DR и CD45RA.Подварианты Т-ОЛЛ диагностируют в соответствии со стадиями блока дифференцировки Т-клеток с учетом различной экспрессии ряда маркеров. Группа EGIL выделяет 4 различные стадии на основе CD2, CD3, CD5, CD7, CD8, CD1a, а также TCR.

Для определения стадии блока созревания в соответствии с нормальным тимопоэзом необходимо дополнительно использовать CyTCR| F1. На этой основе возможно определение трех стадий дифференциров-ки клеток Т-ОЛЛ: незрелые (CyCD3+ CyTCR|F1 - smTCR -), пре-αβ (CyCD3+ CyTCR|F1+ SmTCR-), зрелые (CyCD3+ SmTCR+). Разделение Т-ОЛЛ на TCRγδ+ и TCRαβ + варианты имеет прогностическое значение. В панель включены также дополнительные маркеры (CD44, CD45RA, HLA-DR, CD13, CD33 и CD123).

Прогностически неблагоприятный наименее зрелый подвариант Т-ОЛЛ характеризуется как CyCD3+ CD5lo CD1a-CD8 - с экспрессией стволовоклеточных или миелоидных маркеров CD34, CD117, HLA-DR, CD13 и CD33.

Как и при В-ОЛЛ, оценка лейкозных иммунофенотипов для последующего определения минимальной остаточной болезни необходима уже при диагностике Т-ОЛЛ. В основном определение МОБ при Т-ОЛЛ основывается на определении маркеров Т-клеточных предшественников: CD34, NuTdT, CD1a, CD10.

Иммунодиагностика острого миелобластного лейкоза и миелодиспластического синдрома
Острый миелобластный лейкоз и миелодиспластический синдром - это гетерогенные заболевания, при которых, в противоположность Т-ОЛЛ и В-ОЛЛ, в опухолевый процесс могут вовлекаться несколько клеточных линий на различных стадиях созревания. По этим причинам необходимо детальное иммунофенотипическое изучение нейтрофильной, моноцитарной, эритроидной линий, а также плазмоцитоидных дендритных клеток, базофилов, тучных клеток и мегакариоцитов. Помимо линейной и стадийной принадлежности, устанавливается также аберрантная экспрессия лимфоидно-ассоциированных маркеров. Совокупность данных позволяет не только классифицировать острый миелобластный лейкоз, но и определять в ряде случаев родственные генетические аномалии. Так, острый промиелоцитарный лейкоз с транслокацией 15;17 в типичном случае имеет иммунофенотип промиело-цитов (CyMPO+ HLA-DR - , гетерогенно CD13+, гомогенно CD33 и CD117) с аномально низкой или полностью отсутствующей экспрессией CD15.

Бластные клетки острого миелобластного лейкоза с транслокацией 8;21 часто коэкспрессируют CD19, а острый миелобластный лейкоз с inv(16) часто является CD2+.У больных с миелодиспластическим синдромом роль проточноцитометрического иммунофенотипирования не до конца ясна. В последние годы иммунофенотипирование учитывается как один из дополнительных критериев диагноза миелодиспластического синдрома. Множество работ указывают на наличие иммунофенотипических особенностей (аномалий) у абсолютного большинства больных с миелодиспластическим синдромом, включая случаи с нормальной морфологией клеток.

У больных с указаниями на острый миелобластный лейкоз на основании скрининга острого лейкоза (острые миелобластные лейкозы, острые лейкозы неоднозначной линейной принадлежности, опухоли из плазмоцитоидных дендритных клеток) необходимо использовать панель острого миелобластного лейкоза/ миелодиспластического синдрома. При клиническом или цитоморфологическом подозрении на миелодисплатсический синдром либо при наличии необъяснимых цитопений можно сразу использовать панель антител для диагностики острого миелобластного лейкоза/миелодиспластического синдрома.

При иммунодиагностике острого миелобластного лейкоза/миелодисплатсического синдрома используются 4 каркасных маркера (HLA-DR, CD45, CD34, CD117), что позволяет эффективно (с высокой чувствительностью и специфичностью) обнаруживать бластные клетки в 88% случаев. Антигены CD11b и CD33 для этих целей оказались менее подходящими. Сочетанная экспрессия HLA-DR и CD117 имеет характерные ассоциации с четкими профилями созревания различных миелоидных линий. Наблюдается последовательная утрата CD34 и CD117 в HLA-DR-позитивных моноцитарных и дендритноклеточных предшественниках, а также CD34 и HLA-DR на CD117-позитивных созревающих предшественниках нейтрофилов и эритроцитов.

Иммунодиагностика острого миелобластного лейкоза и миелодиспластического синдрома является наиболее комплексной, для более подробного изучения клеток миелоидного ряда применяется 7 проб. Каждая из них имеет, помимо диагностической и классификационной целей, специфическое предназначение. Проба 1 характеризует нейтрофильное созревание. В пределах нейтрофильной линии маркеры CD10, CD11b, CD13 и CD16 экспрессированы как стадиеспецифические. В комбинации с каркасными маркерами они позволяют детально охарактеризовать созревание нейтрофилов от наиболее незрелых миелоидных бластных клеток до зрелых полинуклеарных нейтрофильных гранулоцитов. Аномалии экспрессии этих маркеров часто наблюдаются у больных острым миелобластным лейкозом и миелодиспластическим синдромом.

Проба 2 характеризует моноцитарную дифференцировку. Маркер CD14 является типичным для моноцитов, однако он экспрессирован только на промежуточных и конечных стадиях созревания моноцитов. Напротив, рецептор CD64 (в меньшей степени CD36) представлен на более ранних стадиях моноцитарной дифференцировки. Использование этих маркеров необходимо для идентификации клеток ранних стадий дифференцировки моноцитарного ряда. Экспрессия CD33 нарастает, начиная с ранних стадий моноцитарного развития до уровней более высоких, чем на гранулоцитарных клетках, что позволяет разграничивать клетки гранулоцитарной и моноцитарной линий. CD11b отсутствует на незрелых моноцитарных клетках, но экспрессирован на более поздних стадиях. В пробе 2 с диагностической целью используется IREM-2 (CD300e). Это новый маркер гликопротеиновой природы. Он представлен на клетках моноцитарной линии и миелоидной дендритноклеточной линии. В моноцитарном ряду CD300e экспрессирован на поздних стадиях созревания, после того как появляется выраженная экспрессия CD14.

При остром миелобластном лейкозе CD300e обнаруживается практически только при моноцитарных лейкозах, причем экспрессия нарастает от монобластных к моноцитарным острым миелобластным лейкозом и хроническим миеломоноцитарным лейкозам. В подгруппе этих лейкозов CD300e появляется раньше, чем CD14. CD36 информативен для характеристики клеток эритроидной диф-ференцировки, а кроме того, присутствует на CD64hi моноцитарных предшественниках. По этим причинам CD64 используется в пробе, характеризующей моно-цитарную дифференцировку, а CD36 - эритроидную. Рецептор CD35 (CR1) экспрессирован на эритроцитах, гранулоцитах, моноцитах и дендритных клетках, а также в ряде случаев острого миелобластного лейкоза.

В сочетании с CyMPO он позволяет разграничивать ранние стадии созревания нейтрофилов и моноцитов.Проба 3 характеризует дифференцировку клеток эритроидного ряда. Информативными для этих клеток являются CD235а (гликофорин А), CD71 и CD36. Гликофорин А экспрессирован как на незрелых эритроидных предшественниках, так и на зрелых эритроцитах. По этой причине он менее подходит для исследования цельного костного мозга или крови. Маркерами клеток эритроидного ряда являются CD233 (белок бэнд-3), CD238 (Kell) и CD105 (эндоглин). CD233 и CD238 не подходят для целей иммунодиагностики. CD36 и CD105 появляются в ходе эритроидной дифференцировки раньше, чем CD235a.

Экспрессия CD105 отмечается позже, чем CD71, повышается и затем исчезает вскоре после утраты мембранного рецептора CD117. Более зрелые эри-троидные клетки не экспрессируют CD105. Напротив, экспрессия CD36 сохраняется на достаточно высоких уровнях на протяжении дифференцировки эритроидных клеток. Относительно экспрессии CD105 при остром миелобластном лейкозе данных мало, но аберрантная экспрессия маркера описана при миелодиспластическом синдроме.

Проба 4 характеризует экспрессию лимфоидных маркеров на миелоидных клетках и аномалии созревания В-клеток. Наиболее частыми маркерами несвойственных линий являются CD19 при остром миелобластном лейкозе с t(8;21), а также CD7 и CD56. Определение ядерного маркера TdT дает информацию о предшественниках В-клеток, что особенно важно в случаях миелодиспластического синдрома. Обнаружение экспрессии CD7 на миелоидных предшественниках используется как дополнительный критерий диспла-зии.

Проба 5 в панели острый миелобластный лейкоз/миелодиспластический синдром разработана для углубленной характеристики стволовых клеток и включает маркеры аберрантности. Антиген NG2 в норме отсутствует на гемопоэтических клетках, однако выявляется при остром миелобластном лейкозе с реаранжировкой гена MLL (примерно 10%) и редких лейкозах из плазмо-цитоидных дендритных клеток (
Проба 6 характеризует мегакариоциты/мегакарио-бласты, базофилы, тучные клетки и плазмоцитоидные дендритные клетки. Целесообразно объединять в пробе CD42 и CD61, меченные одним флуорохромом, для наибольшей точности обнаружения ранних стадий мегакариоцитарной дифференцировки. Если лейкозные клетки экспрессируют CD42a или CD61, необходимо дальнейшее подтверждение мегакариоцитарной природы с использованием CD41 и CD42b. CD203c является уникальным маркером, позволяющим идентифицировать CD117hi тучные клетки. CD203c представлен также на базофилах, слабоположительных по CD117. Оценка рецептора CD123 в сочетании с каркасным маркером HLA-DR позволяет идентифицировать плазмоцитоидные дендритные клетки (CD123+HLA-DR+) и базофилы (CD123+HLADR-). CD4 экспрессирован на плазмоцитоидных дендритных клетках и на моноцитах.

Проба 7 в панели иммунодиагностики острого миелобластного лейкоза/миелодиспластического синдрома предназначена для углубленной характеристики мега-кариобластных лейкозов и системного мастоцитоза. Используются специфические маркеры мегакариоцитарной линии CD41 и CD42b. Дополнительную информацию дает маркер CD9, который хотя и характеризуется широким спектром экспрессии, но в пределах мегакариоцитарной линии появляется на ранних предшественниках. Рецептор CD25 также экспрессирован на ранних стадиях созревания мегакариоцитов. Кроме того, антитела CD25 позволяют определить иммунофенотипически аберрантные тучные клетки при системном мастоцитозе и подозрении на хронический эозинофильный лейкоз (возможно, в комбинации с острым миелобластным лейкозом или миелодиспластическим синдромом).

Иммунодиагностика зрелоклеточных (периферических) лимфом и плазмоклеточных опухолей
Лимфомы из периферических В- и Т-лимфоцитов, NK-клеточные лимфопролиферативные заболевания, опухоли из плазматических клеток - все эти опухолевые процессы нуждаются в иммунологической верификации и диагностике специфических вариантов. На первом этапе осуществляется скрининг, определение того, к какой линии дифференцировки относятся клональные лимфоциты. Используются 12 антител, позволяющих установить Т-, В-клеточные лимфомы, NK-клеточные лимфопролиферативные заболевания и плазмоклеточные опухоли.Зрелые (периферические) В-клеточные лимфомы соответствуют злокачественным аналогам нормальных зрелых В-клеток - наивным клеткам и их потомкам. Классификация ВОЗ зрелых В-клеточных лейкозов и лимфом следует концепции поиска нормального аналога злокачественных клеток на основе определения их соответствия клеткам зародышевого центра или более поздним этапам активации и созревания В-клеток.

Отбор каркасных маркеров для иммунодиагностики периферических В-клеточных лимфом представляет непростую задачу. Это обусловлено тем, что хорошо известны варианты аберрантно низкой экспрессии ряда антигенов CD20 при В-хроническом лимфолейкозе, CD19 при фолликулярной лимфоме, диффузной В-крупноклеточной лимфоме и мантий-ноклеточной лимфоме. Аберрантность CD22 и CD37 известна при некоторых B-клеточных лимфомах. Наиболее приемлемой парой каркасных антител явились CD19 и CD20 (89-98% случаев), добавление к этой панели CD22 позволяло идентифицировать В-клетки во всех случаях. Таким образом, в качестве каркасных антител отобраны CD19, CD20, а также CD45. CD45 позволяют провести отличие от эритроидных предшественников, негемопоэтических клеток, выявить доминирующую популяцию среди лейкоцитов.

Маркеры дифференциальной диагностики B-клеточных лимфом включают наряду с хорошо известными также новые антигены CD200, CD305 (LAIR), CD185 (CXCR5). Предложенный подход позволяет установить типичные иммунофенотипи-ческие образцы для большинства случаев восьми главных нозологий периферических B-клеточныхлимфом - хронического лимфолейкоза, лимфомы Беркитта, диффузная В-крупноклеточная лимфома, фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы и лимфомы из клеток маргинальной зоны. Наибольшие сложности сохраняются при проведении дифференциальной диагностики диффузной В-крупноклеточной лимфомы от фолликулярной лимфомы, а также от лимфомы маргинальной зоны и лимфоплазмоцитарной лимфомы, однозначно разграничить которые также не представляется возможным.

Иммунодиагностика зрелых Т-клеточных лейкозов и лимфом. Эти довольно редкие (~10%) периферические лимфомы, которые возникают из посттимических зрелых Т-клеток, представляют собой весьма гетерогенную группу болезней. Наиболее частой в классификации ВОЗ (2008) остается лимфома из периферических Т-лимфоцитов, неспецифицированная (~30%), что свидетельствует об отсутствии достаточных знаний для определения нормального клеточного эквивалента для Т-клеточных лимфом. В последние годы ряд нормальных аналогов T-клеточных лимфом был установлен. Например, ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома является отчетливым субтипом T-клеточных лимфом, происходящим из Т-хелперных клеток фолликулярных центров, а CD4+ СD25+cyFOXP3+ регуляторные Т-клетки - наиболее близкий нормальный аналог Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых. Анапластическая крупноклеточная лимфома в зависимости от экспрессии гена ALK может быть представлена двумя подтипами с различным прогнозом. Клетки Т-пролимфоцитарного лейкоза в значительной части случаев гиперэкспрессируют киназный коактиватор Tcl1 вследствие хромосомной перестройки гена TCL1.

Лимфомы из периферических Т-клеток относятся к наиболее агрессивным опухолям, исключение составляют только грибовидный микоз, первичная анапластическая лимфома кожи и Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов. Большинство больных имеют четкие симптомы лимфопролиферативного заболевания, часто с вовлечением периферической крови, помимо лимфатических узлов, кожи и других тканей.

Четыре антигена отобраны в качестве каркасных для диагностики T-клеточных лимфом - CD45, SmCD3, CD4, CD8. Создание иммунодиагностикума Т-клеточных опухолей направлено на обнаружение фенотипически аберрантных Т-клеток и точное выделение вариантов лимфом из периферических Т-лимфоцитов в соответствии с классификацией ВОЗ. При отборе дополнительныхмаркеров изучили широкую панель антител к: обще-Т-клеточным антигенам, аберрантно экспрессиро-ванным при T-CLPD, таким как CD2, CD5, CD7; маркерам Т-клеточной дифференцировки (CD27, CD197 /CCR7/, CD45RA, CD45RO); костимуляторным молекулам (CD26, CD28); маркерам активации (CD25, CD38, CD69, HLA-DR); рецептору ИЛ-2-CD122; молекулам, связанным с цитотоксичностью эффекторных Т-больших гранулярных лимфоцитов (CD11c, CD16, CD56, CD57), Ig-подобным рецепторам киллерных клеток (CD158a/b/e/j/k, NKB1), рецепторам лектинового типа (CD94, CD161), цитоплазматическим белкам (перфорину, гранзимам, TIA-1). Исследованы также молекулы, связанные со специфическими подтипами T-клеточных лимфом, такие как CD30, cyTcl1, и с маркерами фолликулярных CD4+-Т-клеток (CD10, CD279). Хорошо известно, что моноклональные Т-клетки часто имеют сниженные уровни обще-Т-клеточных маркеров, таких как CD2, CD5, CD7, наряду с SmCD3 и CD4.

Антитела к этим антигенам обязательны для использования в иммунодиагностике Т-клеточных лим-фом. Это - диагностические маркеры 1-го уровня. Такое же значение имеют классификационные маркеры, позволяющие разделять T-клеточные лимфомы в соответствии с категориями ВОЗ.

CD26 и CD28 полезны для идентификации клеток Сезари:
CD2lo CD4lo smCD3lo CD26 - CD28+. CD30 характерен для системной анапластической крупноклеточной лимфомы (ALK- и ALK+), а также первичного кожного CD30+ T-лимфопролиферативного заболевания. Экспрессия CyTcl рестриктирована главным образом (70-80%) Т-пролимфоцитарным лейкозом. Этот маркер отсутствует на CD30+/- анапластической крупноклеточной лимфоме, Т-лимфобластной лимфоме, нодальной периферической Т-клеточной лимфоме, грибовидном микозе и других периферических Т-клеточных лимфомах. Маркеры 1-го уровня включают также CD11c, CD16, CD57. Вместе с тем молекулы, ассоциированные с цитотоксичностью, отнесены ко 2-му иммунодиагностическому уровню. Сюда включены также дифференцировочные маркеры CD27, CD197 (CCR7), CD45RA, CD45RO, активационные антигены HLA-DR и CD25. Это обусловлено тем, что фенотип патологических клеток при многих периферических T-клеточных лимфомах коррелирует с этапами дифференцировки Т-клеток. Так, клетки Сезари имеют фенотип CD4+ Т-лимфоцитов памяти, а клетки Т-пролимфоцитарного лейкоза соответствуют наивным Т-клеткам или Т-клеткам центральной памяти. Фенотип Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов перекрывается с таковым у активированных эффекторных Т-клеток.

Предложенный подход позволил четко отличать патологические клетки лимфом из периферических T-клеток (синдрома Сезари, Т-пролимфоцитарного лейкоза, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых, CD4+ Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов, ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы) от нормальных CD4+ Т-лимфоцитов. Маркерами дифференциальной диагностики синдрома Сезари явились CD2, CD26, CD7; при Т-пролимфоцитарном лейкозе наблюдается экспрессия CyTcl1. Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых характеризуется как позитивный по HLA-DR и CD25; CD4-позитивный Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов имеет маркеры CD28, Cy-гранзим В, CD7. Для ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы характерен иммунофенотип CD279, HLA-DR, SmCD3.

Лимфопролиферации из Т-лимфоцитов c яркой экспрессией CD8 (CD8hi) в большинстве случаев возможно отличить по иммунофенотипу от нормальных Т-лимфоцитов (CD8hi), причем наиболее информативными являются маркеры CD45RO, CD27, цитоплазматический гранзим В, CD28, CD57, CD45RA. При разграничении патологических CD4 - /CD8 -/10 Т-клеток от нормальных аналогов к числу наиболее важных маркеров относятся CD28, цитоплазматический гранзим В, CD45RA, CD45RO, CD16, CD11c и CD27.

Иммунофенотипических различий между CD8hi TCRαβ Т-клеточным лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов CD8hi-неспецифицированной Т-клеточной лимфомой не установлено. Также не выявлено различий между CD4 - /CD8 - /lo TCRγδ Т-клеточным лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов и CD4 - / CD8 -/lo гепатоспленической Т-клеточной лимфомой.

Иммунодиагностика NK-клеточного хронического лимфопролиферативного заболевания
Заболевания NK-клеток относятся к разряду редких, менее 1% всех лимфом и лимфопролиферативных заболеваний. В соответствии с классификацией ВОЗ выделяют 3 нозологии: агрессивный NK-клеточный лейкоз, экстранодальная (назальный тип) NK/T-клеточная лимфома и хроническое лимфопролиферативное заболевание из NK-клеток. Первые 2 нозологии имеют четкую связь с вирусом Эпштейна-Барр, характеризуются агрессивным течением и низкой выживаемостью. Напротив, NK-клеточное лимфопролиферативное заболевание является новой условной нозологической единицей, которая включает случаи, ранее считавшиеся NK-клеточным лимфоцитозом, хроническим лейкозом из больших гранулярных лимфоцитов с фенотипом NK-клеток и NK-клеточным лимфоцитозом из больших гранулярных лимфоцитов. Уровни лим-фоцитоза, как правило, остаются стабильными на протяжении многих лет, иногда наблюдается спонтанная регрессия, сообщается о возможности трансформации в редких случаях в агрессивный NK-клеточный лейкоз. Как правило, в наиболее частых случаях NK-кле-точного лимфопролиферативного заболевания причиной иммунологического обследования является NK-клеточный лимфоцитоз. Если по данным скрининга зрелых лимфоцитов имеет место абсолютный или относительный CD56+ либо CD56 - /lo/CD45hi лимфоцитоз при отсутствии экспрессии SmCD3, CD4, TCRγδ и CD19, то следует проводить углубленную иммунодиагностику NK-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

В качестве каркасных антител при диагностике NK-клеточных лимфопролиферативных заболеваний использованы CD45, SmCD3, CD56, CD19. Набор потенциальных маркеров NK-клеточных опухолей достаточно широк. Это классические антигены, ассоциированные с NK-клетками, такие как сигнальные молекулы (CD2, CD5, CD7, CD8), низкоаффинный FcγRIII-рецептор CD16, маркеры активации (CD26,CD38, CD45RO, CD69, HLA-DR), рецепторы ИЛ-2 (CD25, CD122), цитотоксические молекулы (CD11c, CD57), цитоплазматические энзимы (перфорин, гранзимы и TIA-1), а также Ig-подобные рецепторы киллерных клеток - KIR (CD158a/b/d/e/l и NKB1), лейкоцитарные Ig-подобные рецепторы LIR (CD85j - LIR1/ILT2), лектиноподобные рецепторы С-типа (NKG2A/D, CD94, CD161), рецепторы естественной цитотоксичности NCR (CD335 /NKp46/, CD336 / NKp44/, CD337 /NKp30/). Критериями необходимости использования антител явились их способность дифференцировать нормальные/реактивные NK-клетки от иммунофенотипически аберрантных NK-клеток, оценка цитотоксического эффекторного фенотипа и стадии созревания количественно увеличенных NK-клеток.

Аберрантные или клональные NK-клетки имеют уникально измененные типы экспрессии CD2, CD7, HLA-DR, CD94 в сравнении с нормальными и реактивными NK-клетками, хотя и существует некоторый перекрест. Эти маркеры включены в первый уровень диагностической панели, куда отнесен также CD16. Данный маркер подтверждает природу CD56lo NK-клеток и полезен в идентификации редких CD16 - /10 NK-клеточных опухолей. Для оценки цитотоксического эффекторного фенотипа и стадии созревания анализируемых NK-клеток используются маркеры, экспрессированные на терминально дифференцированных цитотоксических клетках, - CD11c, CD57, перфорин, гранзим В. Они являются маркерами второго уровня, так как не позволяют отличить нормальные NK-клетки от аберрантных. Дополнительными антителами второго уровня являются CD5, CD25, CD26.

Оцениваемое этим методом количество NK-клеток в крови доноров составило в среднем 2,1% (1,54,5) среди лейкоцитов, что в абсолютных значениях соответствовало 130 (60-290) х103 клеток/мкл. Проведение иммунодиагностики NK-клеточных лимфопролиферативных заболеваний по предложенному алгоритму дает возможность идентифицировать иммунофенотипические профили, позволяющие отличить клональные NK-клетки от нормальных или реактивных (поликлональных) клеток. Наибольшее значение имеют маркеры CD56, CD57, HLA-DR, CD94,а в случаях CD56-/10 - CD7, цитоплазматический гранзим В, цитоплазматический перфорин и CD2.

Иммунодиагностика плазмоклеточных опухолей
Наиболее частыми плазмоклеточными заболеваниями являются множественная миелома и моноклональная гаммапатия неустановленного значения, реже встречаются экстрамедуллярные плазмоклеточные опухоли. Многопараметровое иммунофенотипирование методом проточной цитометрии наряду с клиническими, радиологическими, биохимическими и гематологическими данными представляет надежную информацию для диагностики и классификации плазмоклеточных опухолей. Кроме того, данный метод способствует прогностической стратификации и позволяет проводить мониторинг минимальной остаточной болезни у больных с множественной миеломой после лечения.

Наиболее надежная клиническая информация многопараметрового иммунофенотипирования заключается в возможности идентификации и количественной оценки аберрантных плазматических клеток костного мозга в сравнении с нормальными плазматическими клетками. Чем выше пропорция аберрантных клеток среди плазмоцитов, тем более высок риск злокачественного процесса (например, множественной мие-ломы при проведении дифференциального диагноза с моноклональной гаммапатией неустановленного значения). Сходным образом присутствие
Предложено большое число маркеров плазматических клеток. Обычно рекомендации включают CD38, CD138 и CD45 (наряду с характеристиками светорассеяния) в качестве каркасных маркеров для идентификации и количественной оценки плазматических клеток. Дополнительными маркерами в этом случаемогут являться CD19, CD56, CD117, CD20, CD28, CD27 и CD81. Необходима оценка клональности цитоплазматических легких полипептидных цепей иммуноглобулинов. В числе привлекательных маркеров - мембранный β2-микроглобулин.

Консорциумом «ЕвроФлоу» разработана панель из 12 моноклональных β2 антител в 8-цветной проточной цитометрии (2 пробы). Отобрано 4 каркасных маркера (CD38, CD138, CD45, CD19) для эффективного обнаружения плазматических клеток (CD38, CD138) и разграничения нормальных/реактивных от клональных плазматических клеток (CD19, CD38, CD45). Остальные 8 маркеров использованы для характеристики плазматических клеток. В предложенном иммунодиагностическом подходе дополнительные антитела равномерно разделены на 2 пробы: 1 - CD56, β2-микроглобулин, CyIgK и CyIgλ; 2 - CD27, CD28, CD81, CD117. Пробы 1 достаточно для специфической идентификации, количественной оценки плазматических клеток и их разделения на нормальные/реактивные и патологические (с аберрантным иммунофенотипом). Проба 2 может использоваться по показаниям для более подробной характеристики плазматических клеток.

CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+ Определение относительного количества “наивных” CD4+-лимфоцитов, «клеток памяти», а так же их соотношения рекомендуется выполнять при острых и хронических инфекционных заболеваниях.

CD45 – общий лейкоцитарный антиген представлен на поверхности всех лейкоцитов человека. Уровень экспрессии CD45 нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до зрелых форм. Максимальный уровень CD45 представлен на зрелых лимфоцитах. Существует несколько изоформ CD45. Антиген CD45RA экспрессируется на наивных Т-клетках, В-клетках и моноцитах.

CD45RO – экспрессируется на эффекторных Т-клетках, Т-клетках памяти, В-клетках, моноцитах и макрофагах.

Увеличение Т-лимфоцитов хелперов с фенотипом CD4+CD45RO+ (“клетки памяти”) характеризует активный гуморальный ответ на чужеродный антиген в прошлом и потенциальную возможность развития острых воспалительных при повторном контакте с чужеродным антигеном за счет сформированной иммунологической памяти.

Индекс снижается после перенесенного инфекционного заболевания и увеличение его в периоде реконвалесценции говорит о благоприятном течении заболевания. С возрастом индекс снижается за счет увеличения клеток памяти. Показано, что процент “наивных” CD4-лимфоцитов до начала терапии влияет на последующий прирост CD4-лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией. При развитии инфекции, при хирургическом вмешательстве происходит накопление CD4 +CD45RO+ и снижение CD4+CD45RA+.

Функциональные маркеры CD4+/CD4OL+, CD4+/CD28+, CD8+/CD28+, CD8+/CD57+CD4+/CD4OL+ – тест рекомендуется назначать при нарушении гуморального ответа, для диагностики врожденных иммунодефицитов.

CD4OL – ко-стимулятор пролиферации Т-клеток, экспрессируется активированными Т-клетками. Играет центральную роль на различных фазах В-клеточного ответа на Т- зависимые антигены.

Следствием дефицита CD4OL является ослабление активности дендритных клеток, а именно выработки ими ИН12 и интерферона гамма, необходимых для дифференцировки Т-хелперов 1 и реализации воспалительного варианта клеточного иммунного ответа. Снижение относительного количества этих клеток наблюдается при врожденных иммунодефицитах (гипер–IgM-синдроме, который проявляется в ослаблении гуморального иммунитета – функциональная “слабость” IgM- антител), а также клеточного иммунитета. Численность Т- и В-лимфоцитов при этом не изменяется.

Повышение экспрессии CD4OL на Т-хелперах отмечено при хроническом лимфолейкозе и аутоиммунных заболеваниях.

CD4+/CD28+ – отражает относительное содержание Т-хелперов со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD4+-клетки до 95%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участи в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Котимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе.

Снижение экспрессии CD28 на CD4-лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.

CD8+/CD28+ – отражает относительное содержание ЦТЛ со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD8+-клетки до 50%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участие в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Ко-стимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе. Снижение экспрессии CD28 на ЦТ лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.

CD8+/CD57+ – дополнительный маркер нарушений функционирования иммунной системы при хронических заболеваниях. CD57 экспрессируется на NK-клетках, некоторых Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, моноцитах. Показано, что увеличение экспрессии на ЦТ лимфоцитах замедляет пролиферацию Т-клеток. Увеличение Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+CD57+ отмечено при некоторых хронических инфекциях, в частности, при туберкулезе и ВИЧ-инфекции, синдроме Фелти, ТNK- клеточном лейкозе. При благоприятном течении заболевания, в процессе терапии, количество этих клеток нормализуется.

Тест используют при дифференциации нейроэндокринных опухолей. Снижение – при NK-клеточных лимфомах, болезни Лайма.

CD19+/CD5+популяция В-лимфоцитов (В1клетки). Тест рекомендован как дополнительный диагностический маркер при аутоиммунных заболеваниях и мониторинге лечения аутоиммунных заболеваний.

В настоящее время среди В-лимфоцитов выделяют три субпопуляции: В1, В2 и В-клетки памяти. При аутоиммунных заболеваниях В-лимфоциты начинают экспрессировать рецептор СD5. Их называют В1-клетки. В норме этот рецептор экспрессируется на Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах до 1,3%, клетками лимфоидной ткани селезенки, вилочковой железы, принимает участие в регуляции пролиферации Т-лимфоцитов. Было выявлено, что В1-популяция увеличивается у пациентов, страдающих аутоиммунным тиреоидитом, СД 1 типа, СКВ, ревматоидным артритом, миастенией, в процессе лечения число этой популяции снижалось до нормальных величин. При пролиферации клонов этих клеток и преобразовании их в плазматические клетки происходит избыточная наработка аутоантител.

Метод определения Иммунофенотипирование (проточная цитофлюориметрия, безотмывочная технология)

Исследуемый материал Цельная кровь (с ЭДТА)

Доступен выезд на дом

В профиль входят следующие показатели:

• Лимфоциты, абсолютное значение,
• Т-лимфоциты (CD3+),
• Т-хелперы (CD3+CD4+),
• Т-цитотоксические лимфоциты (CD3+CD8+),
• Иммунорегуляторный индекс (CD3+CD4+/CD3+CD8+),
• В-лимфоциты (СD19+),
• ЕК-клетки (CD3-CD16+CD56+),
• Т-ЕК-клетки (CD3+CD16+CD56+).

Лимфоциты экспрессируют ряд поверхностных и цитоплазматических антигенов, уникальных для своей субпопуляции и стадии развития. Физиологическая роль их может быть различной. Эти структуры являются мишенями при иммунофенотипировании лимфоцитов как антигенные маркёры различных субпопуляций, присутствие которых определяют с помощью меченых моноклональных антител. Поверхностные антигенные структуры на клетках, выявляемые моноклональными антителами, назвали кластерами дифференциации (CD, clusters of differentiation). Кластерам дифференциации в целях стандартизации присвоены определённые номера. Используя флюорохром-меченые моноклональные антитела, связывающиеся с определёнными CD, можно произвести подсчёт содержания лимфоцитов, относящихся к различным по функции или стадии развития субпопуляциям. Это позволяет понять природу некоторых заболеваний, оценить состояние пациента, следить за течением и прогнозировать дальнейшее развитие заболевания.

Основные субпопуляции лимфоцитов

Т-лимфоциты - лимфоциты, созревание которых происходит в тимусе (отсюда их название). Они участвуют в обеспечении клеточного иммунного ответа и контролируют работу В-лимфоцитов, ответственных за образование антител, т. е. за гуморальный иммунный ответ.

Т-хелперы (от англ. «to help» – помогать) – разновидность Т-лимфоцитов, несут на своей поверхности структуры, способствующие распознаванию антигенов, презентированных вспомогательными клетками, участвуют в регуляции иммунного ответа, вырабатывая различные цитокины.

Цитотоксические Т-клетки - распознают фрагменты антигена на поверхности клеток-мишеней, ориентируют свои гранулы по направлению к мишени и высвобождают их содержимое в области контакта с ней. При этом некоторые цитокины являются сигналом гибели (по типу апоптоза) для клеток-мишеней.

В-лимфоциты (от лат. «bursa» - сумка, по названию сумки Фабрициуса, в которой созревают эти лимфоциты у птиц) - проходят развитие в лимфоузлах и других периферических органах лимфоидной системы. На поверхности эти клетки несут иммуноглобулины, функционирующие как рецепторы к антигенам. В ответ на взаимодействие с антигеном В-лимфоциты отвечают делением и дифференциацией в плазматические клетки, вырабатывающие антитела, посредством которых обеспечивается гуморальный иммунитет.

ЕК-клетки (естественные киллерные клетки, или натуральные киллеры) – клетки с естественной, неиммунной цитотоксической активностью к неопластически изменённым клеткам-мишеням. ЕК-клетки не относятся ни к зрелым Т- или В-лимфоцитам, ни к моноцитам.

Т-ЕК (ЕКТ)-клетки – это клетки с естественной неиммунной киллерной активностью, имеющие признаки Т-лимфоцитов.

Кластеры дифференциации антигенов

CD3 – поверхностный маркёр, специфичный для всех клеток субпопуляции Т-лимфоцитов. По функциям относится к семейству белков, формирующих комплекс мембранной передачи сигнала, связанный с Т-клеточным рецептором.

CD4 – характерен для хелперных Т-клеток; представлен также на моноцитах, макрофагах, дендритных клетках. Он связывается с молекулами MHC класса II, экспрессированными на антигенпрезентирующих клетках, облегчая распознавание пептидных антигенов.

CD8 – характерен для супрессорных и/или цитотоксических Т-клеток, ЕК-клеток, большей части тимоцитов. Это рецептор Т-клеточной активации, который облегчает распознавание клеточно-связанных антигенов MHC класса I (major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости).

CD16 – используется вместе с CD56 преимущественно для идентификации ЕК-клеток. Представлен также на макрофагах, тучных клетках, нейтрофилах, некоторых Т-клетках. Это компонент рецепторов, связанных с IgG, опосредующих фагоцитоз, продукцию цитокинов и антителозависимую клеточную цитотоксичность.

CD19 – присутствует на B-клетках, их предшественниках, фолликулярных дендритных клетках, считается самым ранним маркёром B-клеточной дифференциации. Регулирует развитие, дифференциацию и активацию B-клеток.

CD56 – прототипный маркёр ЕК-клеток. Помимо ЕК-клеток присутствует на эмбриональных, мышечных, нервных, эпителиальных клетках, некоторых активированных Т-клетках. CD56-позитивны такие гематологические опухоли, как ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная лимфома, плазмоклеточная миелома (плазмоклеточная лейкемия CD56-негативна). Это молекулы адгезии клеточной поверхности, которые облегчают гомофильную адгезию и участвуют в контактном ингибировании роста, ЕК-клеточной цитотоксичности, развитии нервных клеток.

Литература

1. Зурочка А.В., Хайдуков С.В. и др. - Проточная цитометрия в медицине и биологии. - Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2013. – 552 с.
2. Клиническая иммунология и аллергология / Ред. Лолор-младший Г., Фишер Т, Д. Адельман Д../: Пер. с англ. - М.: Практика, 2000. - 806 с.
3. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. Том 2./Ред. Долгов В.В., Меньшиков В.В./ – М., ГЭОТАР-Медиа, 2012 – 808 с.
4. Практическое руководство по детским болезням. Том 8 Иммунология детского возраста. /Ред. А.Ю.Щербина, Е.Д.Пашанов/ - Москва: МЕДПРАКТИКА, 2006 - 432 с.
5. Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология. - М.: Мир, 2000 — 592 с
6. Ярилин А. А. Иммунология. – М.: ГЭОТАР-Медиа. 2010 - 752 с.
7. Leach М., Drummond М., Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis Hardcover. – WILEY-BLACKWELL, 2013.
8. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B. – USA: W.B Sounders Company, 2006 - 1798 p.