Виды микроскопов, основные характеристики и назначение. Методы микроскопического исследования микроорганизмов

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - способы изучения микроскопического строения различных объектов, размеры к-рых находятся за пределами разрешающей способности глаза. М. м. и. играют важную роль в бактериол., вирусол., цитол., гематол., гистол, и других исследованиях; их применяют также в фармакологии, химии, минералогии, кристаллографии и др. Среди М. м. и. наряду с обычной световой микроскопией широко используют стереоскопическую, темнопольную, интерференционную, фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, электронную микроскопию и др.

Основой для развития М. м. и. явились работы Аббе (Е. К. Abbe) но дифракционным свойствам электромагнитного излучения. С помощью теории Аббе определяют разрешающую способность микроскопов и изготавливают линзы, лишенные хроматической и сферической аберрации, объективы, дифракционные решетки, осветительный и рисовальный аппараты.

Дифракционная решетка Аббе служит для изучения явлений дифракции и состоит из системы тонких прозрачных и непрозрачных чередующихся линий, к-рые прорезают специальным резцом в толще металлического покрытия, нанесенного на стеклянную подложку.

Осветительный аппарат Аббе применяют в микроскопах для освещения объекта в проходящем свете. Он состоит из зеркала (плоского или вогнутого) и конденсора, посредством к-рых поток света направляют в плоскость объекта в виде сходящегося пучка лучей, что обеспечивает более высокую освещенность препарата и улучшает разрешающую способность микроскопа. Конденсор состоит, как правило, из двух-трех линз; ближнюю к объективу линзу устанавливают так, чтобы ее плоская поверхность была параллельна плоскости предметного столика микроскопа. При удалении конденсора от плоскости объекта яркость освещения снижается, однако возрастает контрастность изображения.

Рисовальный аппарат Аббе служит для зарисовки с гистол, препаратов. Он состоит из расположенной над окуляром микроскопа системы стеклянных призм, к-рая направляет в глаз исследователя световые лучи, прошедшие через гистол, препарат и отраженные с помощью зеркала от листа бумаги, лежащей возле микроскопа. Благодаря этому наблюдатель видит совмещенное изображение препарата и своей руки, очерчивающей, напр., карандашом контуры деталей гистол, картины препарата.

При пользовании М. м. и. важное значение приобретает правильная установка освещения, к-рую обычно проводят по методу Келера. Для этого автономный осветитель, напр. ОИ-19, располагают так, чтобы плоскость ирисовой диафрагмы осветителя находилась на расстоянии 15-25 см от центра зеркала микроскопа. Затем через закрытую на 1/2-1/3 диафрагму проецируют изображение нити лампы накаливания осветителя в центр зеркала микроскопа, прикрытого для облегчения наблюдения листом белой бумаги. Изменяя расстояние между микроскопом и осветителем, производят фокусировку изображения нити накаливания и затем зеркалом микроскопа направляют изображение в его объектив. При этом величина освещенного пятна должна совпадать с диаметром апертурной диафрагмы микроскопа, резкое изображение к-рой можно получить, изменяя положение конденсора и плоскости зеркала. В заключение раскрывают апертурную диафрагму микроскопа и с помощью макро- и микровинтов микроскопа получают яркое и четкое изображение объекта.

При работе с малыми увеличениями микроскопа этот способ не всегда позволяет получить полное и равномерное освещение поля зрения. В этих случаях снимают или отводят в сторону фронтальную линзу конденсора, применяют конденсор с большим фокусным расстоянием. При широко открытой апертурной диафрагме микроскопа изображение бывает недостаточно контрастным. В процессе диафрагмирования увеличивается контрастность изображения и возрастает глубина резкости, но может снизиться разрешающая способность микроскопа за счет нарастающих при этом дифракционных явлений. При смене объектива изображение следует снова сфокусировать в фокальной плоскости при закрытой диафрагме осветителя. В случае отклонения оси осветителя от оси объектива микроскопа края изображения могут быть освещены неодинаково. Чтобы освещенность краев изображения стала одинаковой и равномерной по всей площади поля зрения, наблюдая изображение через окуляр, перемещают осветитель.

Установку освещения по методу Келера применяют также при изучении препаратов в так наз. темном поле. В этом случае заменяют обычный конденсор темнопольным и, наблюдая в окуляр, медленно поднимают конденсор до возникновения темнопольного изображения.

Объекты, изучаемые под микроскопом, могут быть прозрачными, а также непрозрачными, т. е. изменяющими амплитудные и фазовые свойства направленного на них электромагнитного излучения. В зависимости от свойств объекта изменяются физ. свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плоскость и направление распространения волны, что используют в М. м. и. Для микроскопического исследования окрашенных объектов применяют световой микроскоп. Цвет изображения и различия в окраске нередко позволяют судить о хим. природе отдельных структур изучаемого объекта, но не дают возможности оценить его жизнедеятельность (движение, хемотаксис, слияние и др.), т.к. при окраске часто используют хим. или температурную фиксацию, убивающую биол, объект, но обеспечивающую эффективное окрашивание. В отличие от исследования фиксированных биол, объектов, витальная микроскопия основана на прижизненном окрашивании, в результате к-рого многие структуры живой клетки мало изменяются под действием специальных красителей. Витальная микроскопия может проводиться и без окрашивания, если в обычный световой микроскоп ввести темнопольный конденсор.

Ультрафиолетовая микроскопия используется в цитол, и гистохимических исследованиях. Она позволяет изучать локализацию, количественное распределение в клетках и тканях высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты) и наблюдать за их динамикой в процессе жизнедеятельности. Этот метод дает возможность без предварительной фиксации и окраски препаратов рассматривать исследуемый материал, напр., с целью прижизненного изучения микрообъектов.

Ультрафиолетовая абсорбционная микроскопия основана на способности нек-рых веществ, входящих в состав тканей и клеток, прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны.

При исследовании живых или фиксированных неокрашенных объектов возрастает контрастность изображения за счет избирательного поглощения ультрафиолетовых лучей высокомолекулярными соединениями. В частности, важное значение ультрафиолетовая микроскопия имеет для изучения распределения в клетке нуклеиновых к-т, поглощающих ультрафиолетовое излучение в участке спектра ок. 260 нм. Поглощение ультрафиолетового излучения белками зависит от входящих в их состав ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина), дающих максимум поглощения в участке спектра ок. 280 нм. Для получения наглядного представления о распределении в препарате веществ изучаемый участок фотографируют в ультрафиолетовом свете с разной длиной волн. В последующем фотоснимки переснимают на цветную пленку в хромоскопе, в к-ром перед снимком, сделанным в коротковолновых лучах, помещают синий светофильтр, в лучах средней длины - зеленый и в длинноволновых лучах - красный светофильтр. Эти снимки с помощью специального приспособления совмещают на экране, и изображение становится видимым, передавая условными цветами различия поглощения ультрафиолетовых лучей отдельными структурами клетки.

Ультрафиолетовую флюоресцентную микроскопию, как и абсорбционную, используют для цитохим, изучения живых или фиксированных неокрашенных объектов, в связи с тем что спектры ультрафиолетовой флюоресценции веществ отличаются друг от друга.

Инфракрасная микроскопия дает возможность установить структуру объекта по характеру поглощения света с длиной волн 800-1000 нм. Широкое распространение имеет исследование в инфракрасном свете веществ, частично или полностью непрозрачных в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для инфракрасной микроскопии биол, объекты не подвергают дополнительной хим. обработке. При помощи инфракрасного микроскопа производят исследование импрегнированной нервной ткани и капилляров в гистол, срезах, распознают повреждения сетчатки и радужной оболочки глаза.

Для повышения разрешающей способности М. м. и. создают оптические системы, основанные на электромагнитных линзах с применением в качестве источника излучения потока электронов, напр, для электронной микроскопии (см.) используют пучок быстрых электронов, а роль линз выполняют электрические и магнитные поля определенной конфигурации. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая (растровая) микроскопия, к-рая дает возможность получить объемное изображение объекта за счет излучаемых им вторичных электронов.

В нек-рых микроскопах плавное, бесступенчатое увеличение без смены объектива позволяет в пределах широкого диапазона установить интересующие детали объекта, напр, динамику биол, процессов, происходящих в тканевых культурах.

Библиография: Аппельт Г. Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959, библиогр.; Биофизические методы исследования, под ред. Ф. Юбера, пер. с англ., М., 1956; Д e Робертис Э., Новинский В. и Саус Ф. Биология клетки, пер. с англ., с. 94, М., 1973; Дитчберн Р. Физическая оптика, пер. с англ., М., 1965; Ильин P. С., Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторные оптические приборы, М., 19 66, библиогр.; Л и л л и Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и д р. Микроскопы, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевский.

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использование для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Темнопольная микроскопия

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

На середину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углубления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают покровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления. Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного иммерсионного масла.
Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1 - дуговая лампа; 2 - кварцевый коллектор; 3 - кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4 - передняя часть коллектора; 5 - ультрафиолетовый фильтр; 6 - призма; 7 - пластинка из уранового стекла; 8 - окулярный фильтр, поглощающий
ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Основным методом изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - главный метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть с помощью микроскопа, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d = λ/2. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние, и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с волнами различной длины. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет (рис. 2.1). Минимальная длина волны видимой части спектра примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние приблизительно составляет 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.

Таким образом, с помощью светового микроскопа можно увидеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротко-

Рис. 2.1. Микроскопы для биологических исследований:

а - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - ту-бусодержатель; 3 - наклонный тубус; 4 - окуляр; 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диафрагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зеркало; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт; б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизированной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образцов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок анализа изображений; 5 - датчик видеосигнала; в - конфокальный микроскоп: 1 - световой микроскоп; 2 - регистратор изображения (фотоэлектронный умножитель);

3 - сканирующее устройство для перемещения светового луча по оси X, Y, Z;

4 - блок питания и стойка управления лазерами; 5 - компьютер для обработки изображений

волновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксе-ноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридиновый оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов акридиновым оранжевым ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Существует много красителей, с помощью которых можно выявить белки, липиды, внутриклеточные ионы кальция, магния, натрия и др. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцентной микроскопии.

Для повышения контрастности флюорохромированных объектов применяется конфокальный вариант оптического микроскопа (см. рис. 2.1, в). В качестве освещения используется пучок монохроматического света малого диаметра, который создает лазерный источник. В каждый момент времени в фокусе микроскопа находится небольшой участок (объем) клетки. Пучок света перемещается по объекту (сканирует объект по осям X, Y, Z). При каждом перемещении пучка света по одной из линий сканирования получается информация об исследуемой структуре, находящейся в данной точке (объеме) по линии сканирования (оптическом срезе клетки), например о локализации белков в составе микротрубочек в клетке. Вся полученная информация от каждой точки сканирования клетки передается на компьютер, объединяется с помощью специальной программы и выдается на экран монитора в виде контрастного изображения. С помощью данного метода микроскопии получается информация о форме клеток, цитоскеле-те, структуре ядра, хромосом и др. С помощью программы компьютер на основе полученной информации по каждой линии сканирования создает объемное изображение клетки, что позволяет рассматривать клетку под разными углами зрения.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод основан на том, что свет, проходя структуры с различным коэффициентом преломления, изменяет свою скорость. Используемая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т. е. яркости получаемого изображения. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию (огибание волнами) структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. В клинике этот метод применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности Treponema pallidum, вызывающей сифилис, и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани. Дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского) используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяется по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка накладываются друг на друга. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется интерференция, возникающая при комбинации двух наборов волн и создающая изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темно-польной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микровидеосъемки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: первый (поляризатор) - между пучком света и объектом, а второй (анализатор) - между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось,

которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры, обладают свойством вращать ось световых лучей, исходящих из поляризатора. При изменении оси вращения данные структуры проявляются как светящиеся на темном фоне. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии было создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 2.1). В электронном микроскопе используется поток электронов с волнами более короткими, чем в световом микроскопе. При напряжении 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т. е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В гистологии используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ), сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ) и их модификации. С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Современными вариантами приборов для изучения поверхности объекта является атомно-силовой микроскоп и сканирующий туннельный микроскоп.

Электронная микроскопия с использованием метода замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 °С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультрамикро-томии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Хотя бы один раз в год все люди проходят медицинские осмотры. Но мало кто знает, что происходит с их анализами в лаборатории, и какие диагностические мероприятия с ними проводят. А ведь от правильного лабораторного обследования зависит не только здоровье, но иногда даже жизнь. Поэтому методы микроскопического исследования играют немаловажную роль в выявлении и своевременном предупреждении различных вирусных и инфекционных заболеваний.

Микроскопия и ее разновидности

Микроскопия – исследование объектов посредством микроскопа. Предназначена для изучения микроорганизмов, а также иных объектов, которые непостижимы человеческому глазу. Имеет следующую классификацию:

• Стереоскопическая.

Используется для исследования объектов под разными углами, при этом изучая их двумя глазами. Увеличение небольшое – 120-ти кратное. Такой вид микроскопии используют в оперативном лечении маленьких структур организма, которые недосягаемы для человеческого глаза; в изучении мёртвых тканей; в судебной медицине.

• Инфракрасная.

Принцип действия – поглощение непрозрачных объектов, структурами света, длина волн которых достигает 700-1200 нанометров. Чтобы провести инфракрасную микроскопию не нужно производить специальную химическую обработку объекта. Данный метод применяется в зоологии, науках о биологической природе человека. Используется микроскопия в медицине : инфракрасную микроскопию используют в нейрохирургических целях, а также при изучении глаз, их анатомии и физиологии.

• Ультрафиолетовая.

Изучает свойства объекта посредством определения длины волн, которые поглощают ультрафиолетовое излучение, являясь способностью отдельного вещества, клетки, ткани данного объекта. Такой способностью обладают биополимеры, которые хранят генетический код; нуклеиновые кислоты; пропионовые кислоты; альфа-аминокислоты; калиевая соль; продукты азотистого обмена; лекарственные вещества; кристаллические вещества с температурой плавления больше 290 градусов. Благодаря ультрафиолетовой микроскопии определяют место концентрации искомых веществ, а, если объект живой, то можно исследовать его структурные изменения в процессе жизнедеятельности.

• Люминесцентная.

Основной принцип работы – изучение объектов посредством их свойств свечения в ультрафиолетовых лучах или сине-фиолетовой части спектра. Большинство биологических веществ, например, белки, молекулы небелковой природы, низкомолекулярные органические соединения и лекарственные препараты имеют «врожденную» люминесценцию. Иные вещества светятся лишь после добавления конкретных красителей – синтетических соединений природного характера, которые начинают светиться при контакте с ультрафиолетовыми и синими лучами. Такой краситель может попадать в клетку при малейшем контакте, а может распределяться по клеткам избирательно, окрашивая при этом отдельные биосоединения изучаемого объекта. В мероприятиях, посвященных гистохимическим исследованиям, метод люминесцентной микроскопии – это единственный способ обнаружить вирусную концентрацию в клетках, изучить структуру распада продуктов обмена веществ, определить антигены и антитела. Лечение таких болезней, как герпес, гнойное поражение железистых органов, воспаление тканей печени, грипп – не обходится без люминесцентной микроскопии. Также, с ее помощью можно распознать злокачественную опухоль, предупредить сердечно-сосудистые заболевания, исследовать микрофлору слизистой оболочки носа и диагностировать вирусные недуги.

• Интерференционная.

Имеет общую структуру анализа с фазово-контрастной микроскопией, но в отличие от последней, где можно изучать лишь контуры исследуемого объекта, здесь появилась возможность делать микроскопическую экспертизу прозрачных объектов, а также брать количественный анализ. Такой результат появляется вследствие преломления луча света на два пучка: первый проходит через структурные компоненты изучаемого объекта, а второй минует их. В объективе микроскопа кажется, что оба пучка соединяются и налагаются друг на друга. Разница фаз, которая возникает, можно измерить посредством определения массы разнообразных клеточных структур. Если измерять данную разницу последовательно, используя показатели преломления, то можно узнать плотность, ширину и толщину изучаемых объектов и их тканей, содержится ли в них вода или иные компоненты, имеется ли в них белок. Химические и физические свойства мембран, активность ферментов, обмен веществ на клеточном уровне – это лишь малая часть того, что можно узнать благодаря интерференционной микроскопии.

• Фазово-контрастная.
• Рентгеновская.

Применяется для исследования особо малых объектов, которые по своим размерам не больше рентгеновской волны (0,01-1 нм). Подразделяется на следующие подвиды: проекционная, работающая посредством источника излучения и регистрирующего устройства; отражательная – использует специальные монокристаллы, система зеркал, рассеянное на кристалле рентгеновское излучение.

Своё применение рентгеновская микроскопия нашла в изучении генезиса минералов, медицине, а также науке, изучающей химический состав и структуру металлов. Отличительной особенностью данного метода является возможность изучать непрепарированные живые клетки.

Этот рентгеноструктурный анализ может быть лазерным – когда изучаются одиночные молекулы и их связи.

• Поляризационная.

Лучи, которые появляются посредством поляризации двух взаимоперпендикулярных полостей, образуют свет, в котором исследуют различные объекты – это и есть принцип действия поляризационной микроскопии. Между источником излучения и объектом помещают специальные призмы с эффектом двойного лучепреломления, которые отражают электромагнитные и звуковые волны. В сочетании со специальным светофильтром, такая конструкция позволяет изучать анизотропные структуры клеток, микроскопические компоненты тканей, молекулярную организацию структуры объекта. Поляризационная микроскопия используется для исследования клеток и тканей растительных и животных организмов. Также применяется при идентификации возбудителя различных иммунных заболеваний; при изучении жизни клеток, их жизненно важных компонентов, их функций и процесса размножения. Основное назначение данного метода исследования – изучение животных и растительных тканей, минералов, анизотропных микрообъектов.

• Электронная.

Применяется в случае, если объект находится вне пределов видимости оптического микроскопа. Обычно, размер исследуемых образцов, которые изучаются данным методом – 1 микрон и менее. Принцип действия заключается в использовании потока отрицательно заряженных частиц, которые играют роль светового луча. Линзы в таком микроскопе – магнитные. Отдельные участки исследуемых объектов по-разному задерживают отрицательно заряженные частицы, поэтому изображение получается чёрно-белым, где сам объект увеличен в тысячи раз. Сегодня электронная микроскопия используется для изучения строения, функции и развития клетки. Также применяется в сферах исследования морфологии и структуры микроорганизмов, их жизнедеятельности и генетики. Немаловажный вклад данный метод внес в развитие такой науки как вирусология. Если бы не электронная микроскопия, законы жизнедеятельности клеток были бы до сих пор не изучены, а значит многие онкологические заболевания были бы неизлечимы.

Для того, чтобы провести электронную микроскопию, объекты, которые являются изучаемым материалом, подвергаются физической и химической фиксации, после чего их обезвоживают и разделяют на ультратонкие срезы, чтобы было легче их контрастировать и исследовать.

Электронная микроскопия позволяет увеличивать изображение объекта на много сотен тысяч раз. Минусом данного метода я является то, что он предназначен для изучения неактивных, обезвоженных, мёртвых объектов. Научный вклад в медицину этой методики микроскопии – очень велик, но применять ее в диагностических и практических целях – пока невозможно. Световая и электронная микроскопия имеет общий признак – увеличение изображения с последующим описанием форм объекта и сравнением этих форм с функциональными, а также химическими свойствами

• Иммуноэлектронная микроскопия.

Применяется для исследования взаимодействия антигена и антител. Принцип действия: материал, который исследуется смешивают с иммунной сывороткой, инкубируют его; жидкость и твердые частицы разделяются на фракции по плотности; затем происходит осаждение антител и разделенных частиц на объект; после этого, к смешанному клеточному осадку добавляют вещество, усиливающее контрастность; и только после всего этого, полученный препарат исследуют под микроскопом.

Применяется для диагностики вирусного гепатита, а также для выявления антигенов, которые будут бороться с различными вирусными заболеваниями.

• Световая.

Обеспечивает цветное изображение, увеличенное в две-три тысячи раз. Также, при световой микроскопии возможно продолжительное наблюдение за подвижным объектом, и что немаловажно – микрокиносъёмка. Используется для оценки хода развития объекта, его состояния движения, а также для исследования его изменений под воздействием окружающих его факторов. Кроме разрешающей способности микроскопа, важную роль играет амплитуда светового луча и типология исследуемого объекта, так как свойства последнего имеют огромное влияние на оптическое излучение: цвет, контрастность, резкость, световая фаза, плоскость, по которой распространяется волна. Именно благодаря этим факторам и строится методология микроскопических исследований, например, в данном виде микроскопии, объект окрашивают, чтобы определить его свойства, потому что краска помогает изучить конкретные свойства убитых клеток. Но это не значит, что световая микроскопия занимается изучением лишь мертвых биологических объектов. Благодаря темнопольной микроскопии (подвид оптической), где свойства и чёткость изображения зависит ли излучения, которое рассеивается исследуемым образцом, освещающий световой пучок не попадает в глазок, и картинку изучаемого образца учёные видят в рассеянном свете. Используется для изучения водных одноклеточных организмов, а также живых объектов, которые могут быть как окрашенными, так и наоборот.`]]

Световая микроскопия

При использовании этого метода исследователь оперирует следующими понятиями:

Увеличение – физическое свойство линз объектива и окуляра. Увеличение микроскопа оценивают как произведение увеличения объектива и увеличения окуляра.

Минимальный размер наблюдаемого объекта (d) и разрешение микроскопа – значения, зависящие от характеристик линз объектива, длины волны и от коэффициента преломления среды, отделяющей изучаемый объект от линз объектива или конденсора. Увеличивают разрешение микроскопа применением жидких сред (иммерсионные среды), т.к. коэффициент их преломления больше коэффициента преломления воздуха. В микроскопии используют масляную, глицериновую и водную иммерсионные среды. Теоретически возможный предел разрешения светового микроскопа – 0,2 мкм (минимальное расстояние, на котором различимы два объекта).

Специальные виды микроскопии

Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.

Поляризационная микроскопия - формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов.

Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флуоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.

Флюоресцирующие красители (флюоресцин, родамин и др.) избирательно связываются со специфическими макромолекулами.

Электронная микроскопия

Теоретическое разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм.

Просвечивающий ЭМ состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки.

Сканирующий ЭМ применяют для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.

Метод сколов (замораживания-скалывания) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе.