Cytokínový systém. Klasifikácia

MUDr., prof. Tsaregorodtseva T.M., vedúci. laboratórium imunológie

Centrálny výskumný ústav gastroenterológie Moskovského ministerstva zdravotníctva

Cytokíny (CK) hrajú dôležitú úlohu pri vzniku a priebehu ochorení rôznych orgánov a systémov, vrátane tráviacich orgánov. CK sú proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou, endogénne biologicky aktívne mediátory, ktoré zabezpečujú prenos signálu, výmenu informácií medzi sebou odlišné typy bunky v rámci jedného orgánu, komunikácia medzi orgánmi a systémami, a to ako za fyziologických podmienok, tak aj pri pôsobení rôznych patogénnych faktorov. U zdravých jedincov sú CK produkované v minimálnom množstve postačujúcom na prejavenie biologického účinku, s patologických stavov ich obsah rastie exponenciálne.

CK sú syntetizované aktivovanými bunkami, predovšetkým lymfocytmi, monocytmi a tkanivovými makrofágmi. Rôzne bunky, ako sú makrofágy, lymfocyty, endoteliocyty, môžu syntetizovať rovnaké CK. Na druhej strane tie isté bunky môžu produkovať rôzne CK.

Syntéza CK je geneticky naprogramovaná, krátkodobá a regulovaná inhibítormi. Zvýšený obsah CK môže byť spôsobená nielen zvýšením ich syntézy, ale aj porušením katabolizmu, včasným vylučovaním z tela v prípade poškodenia pečene a obličiek.

Zvýšená syntéza CK vedie k aktivácii mnohých rôznych typov buniek. Realizuje sa tak široká interakcia na subcelulárnej, bunkovej, orgánovej, systémovej úrovni, tvorba komplexnej ochrannej reakcie zameranej na neutralizáciu škodlivých činidiel, ich deštrukciu, elimináciu z tela, udržanie jeho homeostázy, štrukturálnej a funkčnej integrity.

Klasifikácia cytokínov

V súčasnosti bolo identifikovaných viac ako 100 CC a ich počet neustále rastie. Spomedzi CK sa rozlišujú tieto hlavné skupiny: interleukíny (IL), interferóny (IF), tumor nekrotizujúce faktory (TNF), rastové faktory, chemokíny atď.

Mechanizmy pôsobenia

CK realizujú svoj biologický účinok väzbou na receptory lokalizované na membránach cieľových buniek – imunokompetentných, endotelových, epitelových, buniek hladkého svalstva a iných špecializovaných buniek. Mimo bunky sa CK môže viazať na cirkulujúce receptory, ktoré ich transportujú do lézie a odstraňujú z cievneho riečiska. Syntéza receptorov prebieha intenzívnejšie a dlhšie ako syntéza CK, čo prispieva k úplnejšej realizácii ich biologického účinku a odstráneniu z tela.

Funkčné vlastnosti

CK majú široké spektrum biologických vlastností: indukujú a regulujú také fyziologické a patologické procesy, ako je rast, proliferácia, bunková diferenciácia, metabolizmus, zápal a imunitná odpoveď. CC sú multifunkčné, univerzálne, pleiotropné. Rovnaké CK môžu interagovať s receptormi rôznych buniek, zatiaľ čo CK s podobnou štruktúrou môžu mať rôzne biologické účinky, zatiaľ čo CK, ktoré sú štrukturálne odlišné, môžu spôsobiť rovnaký účinok.

V tele CK navzájom úzko interagujú a vytvárajú univerzálnu sieť, ktorá spúšťa a reguluje kaskádu zápalových, imunitných a metabolických procesov, lokálnych aj systémových, zameraných na neutralizáciu a elimináciu patogénnych agensov. Tento komunikačný biologický systém má značnú mieru bezpečnosti vďaka duplikácii väčšiny funkcií rôznymi CC, ich zameniteľnosti a kombinácii autokrinnej a parakrinnej regulácie. Napriek tomu, so všetkou rozmanitosťou funkcií, špecifickým CC dominujú určité vlastnosti vyvinuté v procese evolúcie.

Cytokíny a zápaly

Prozápalové CK (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, TNF-α) sa vyznačujú širokým rozsahom biologických účinkov na početné cieľové bunky. IL-1β pod pôsobením patogénnych faktorov je jedným z prvých, ktorý je zahrnutý v reakcii tela, aktivuje T- a B-lymfocyty, iniciuje syntézu IL-6, TNF-α, PG, má pyrogénny účinok . IL-6 je produkovaný hlavne lymfocytmi, na jeho syntéze sa však môžu podieľať hepatocyty, Kupfferove bunky, endotel, epitelové bunky. žlčových ciest fibroblasty. IL-6 pôsobí nielen pro-, ale aj protizápalovo, dokončuje akútnu fázu zápalu, aktivuje B-lymfocyty, reguluje proliferáciu pečeňových buniek, žlčových ciest, tvorbu fibrózy, tvorbu granulómov. . IL-8 - chemokín - stimuluje a reguluje adhéziu, chemotaxiu leukocytov k lézii. TNF-α je kľúčová multifunkčná CK systémového účinku, hrá dominantnú úlohu pri rozvoji lokálnych a celkových patologických procesov, stimuluje syntézu prozápalových IL, proliferáciu endotelových buniek, reguluje tonus cievy. TNF-a zvyšuje oxidačný stres, má silný cytotoxický účinok, vyvoláva nekrózu nádorových, infikovaných a iných postihnutých buniek. Stimuláciou cytotoxickej, fagocytárnej aktivity, využitím defektných buniek, neutralizáciou bakteriálnych toxínov sa TNF-α podieľa na tvorbe ochranných reakcií organizmu. Intenzívna dlhodobá syntéza tejto CK však prispieva k hemodynamickej poruche, rozvoju hypertermie, kachexie, nekróz, toxických septický šok, zlyhanie viacerých orgánov. IL-12, stimuluje syntézu IFN-γ - univerzálneho imunomodulátora, ktorý zvyšuje adhezívnu, cytotoxickú, fagocytárnu aktivitu buniek, ktorá má antiproliferatívny, antivírusový účinok.

Protizápalové cytokíny - IL-4, -10, -13, -17 - inhibujú zápal, inhibujú syntézu prozápalových CK, tvorbu vysoko aktívnych metabolitov kyslíka a dusíka. IL-4 stimuluje proliferáciu a diferenciáciu B-lymfocytov na plazmatické bunky, syntézu imunoglobulínov, protilátok a humorálnu imunitnú odpoveď. Toto je stručný popis hlavných biologických funkcií kľúčových CK, ktoré regulujú lokálne aj systémové zápalové procesy. Zápal je univerzálna reakcia, ktorá sa v tele vyvíja v reakcii na pôsobenie rôznych škodlivých faktorov. Väčšina chorôb tráviaceho systému - gastritída, pankreatitída, hepatitída, cholecystitída a iné - sú z veľkej časti spôsobené rozvojom zápalu. CK reguluje intenzitu, prevalenciu a trvanie zápalu. Na jednej strane prozápalové CK zvyšujú javy zmeny, deštrukcie, stimulujú syntézu proteínov akútnej fázy a oxidačný stres. S ďalším - skorý vývoj adekvátne zápalové procesy pomáhajú obmedziť léziu, zvýšiť bariérové ​​funkcie, regenerovať, hojiť defekt tkaniva a predchádzať systémovým komplikáciám.

Cytokíny a imunitná odpoveď

CK sa priamo podieľajú na tvorbe tak nešpecifickej obrany, ako aj špecifickej imunitnej odpovede, ktoré spolu tvoria jeden integračný bunkovo-humorálny obranný systém organizmu pôsobením patogénnych agens. V prípadoch, keď je poškodzujúcim faktorom nosič geneticky cudzej informácie, zápalové procesy zapínajú imunitné mechanizmy. Hlavnými bunkami, ktoré implementujú imunitnú odpoveď, sú makrofágy, T- a B-lymfocyty a plazmatické bunky. Avšak mnohí tkanivových buniek(endotel, epitel, hladké svaly, pečeň atď.) sa zúčastňujú imunitnej odpovede, pričom interagujú s imunokompetentnými bunkami. Vedúcu úlohu vo vývoji a regulácii imunitnej odpovede majú T-lymfocyty, ktorých populácia zahŕňa T-pomocníky, T-supresory a cytotoxické T-lymfocyty. T-pomocníci (Tx) produkujú CK s rôznymi funkčnými vlastnosťami. Th typ 1 syntetizuje IFN-y, IL-2, TNF-a; Th11 typ - IL-4, -5, -6, -10, -13, vyvolávajúci bunkovú a humorálnu imunitnú odpoveď. V lamina propria a Peyerových plátoch gastrointestinálneho traktu sú lokalizované prevažne typy Tx 11, ktoré stimulujú humorálnu imunitnú odpoveď namierenú proti početným bakteriálnym antigénom, ktoré ovplyvňujú gastrointestinálnu sliznicu, a realizujú ju hlavne IgA.

Cytokíny hrajú vedúcu úlohu v regulácii hlavných štádií imunitnej odpovede. V závislosti od povahy patogénneho agens, intenzity a trvania antigénnej stimulácie a počiatočného stavu imunitného systému organizmu môže CK pôsobiť ako antagonista aj synergista, pričom sa navzájom dopĺňajú. Pri ochoreniach tráviaceho systému (DOP) sa tvorí integrovaná odpoveď imunitného systému sprostredkovaná bunkovou a humorálne faktory, ktorej konečným cieľom je inaktivácia a odstránenie patogénnych agens z tela. Fungovanie imunitného systému je za fyziologických podmienok determinované vyváženou produkciou regulačných cytokínov T-helper typu 1 a 11. Porušenie cytokínovej rovnováhy hrá významnú úlohu v chronicite a progresii MDO.

Na stanovenie kvantitatívneho obsahu CK sa používa vysoko informatívna metóda enzýmového imunotestu s použitím vysoko citlivých testovacích systémov, vr. a domácej produkcie.

Výsledky dlhoročného výskumu realizovaného v Ústrednom výskumnom ústave gastroenterológie umožnili identifikovať znaky zmien cytokínového stavu v KOD v závislosti od etiologický faktor, varianty priebehu, štádium, trvanie ochorenia, prebiehajúca terapia.

Pre také chronické recidivujúce ochorenia tráviaceho systému (CRDOP) ako je peptický vred, cholelitiáza, pankreatitída je charakteristické mnohonásobné, relatívne krátkodobé zvýšenie obsahu periférnej krvi širokého spektra CK, čo odráža časovú postupnosť ich syntézy, dynamika patologického procesu. V skorých štádiách a vrchole exacerbácie CRPD, vo fáze alteratívno-deštruktívnych procesov, prevláda zvýšenie hladiny IL-1β, -6, -8, -12, IF-γ, TNF-α (na r. priemer - 240–780, u niektorých pacientov s vyjadrenou aktivitou - 1100-3200 pg/ml, u kontroly - až 40 pg/ml). S posilňovaním regeneračno-regeneračných procesov výrazne klesá obsah prozápalových CK, zvyšuje sa protizápalový (IL-4, -10). Počas prechodu do remisie sa u väčšiny pacientov koncentrácia CK blíži k normálnym hodnotám. Následne v dynamike patologického procesu pri CRPD dochádza k významným zmenám obsahu CK s rôznymi funkčnými vlastnosťami, ich pomeru.

Pri takých chronických progresívnych ochoreniach (CPRD), ako je chronická hepatitída, cirhóza pečene, Crohnova choroba, ulcerózna kolitída, mierny (priemer - 160-390 pg/ml), pretrvávajúci, relatívne monotónny nárast obsahu kľúčových pro- a anti -charakteristické sú zápalové CK, ktoré sa zvyšujú pod vplyvom nepriaznivých faktorov, rozvoja komplikácií, sprievodných ochorení. S predĺžením trvania ochorenia, frekvenciou recidív, syntézou CK klesá v dôsledku inhibície funkčnej aktivity imunitného systému, vyčerpania jeho zdrojov, rozvoja sekundárnej imunodeficiencie v dôsledku progresie samotné ochorenie, ako aj inhibičný účinok medikamentóznej terapie.

Cytokíny regulujú intenzitu lokálnych a systémových patologických procesov. Ochorenia žalúdka, pankreasu, žlčníka, pečene, tenkého a hrubého čreva sú sprevádzané zmenou obsahu CK v poškodenom tkanive a priľahlej oblasti, ktorá charakterizuje intenzitu lokálnej imunitnej odpovede. Výrazné zvýšenie koncentrácie CK v periférnej krvi je odrazom systémovej reakcie organizmu, najmä imunitného, ​​hematopoetického systému na lokálne poškodenie orgánov a môže slúžiť ako jeden z indikátorov intenzity zápalového procesu, imunitných procesov, aktivity a progresie ochorenia.

Etiologický faktor má významný vplyv na hladinu cirkulujúceho CK pri CHOP. Zvýšenie obsahu CK pri chronických infekčných, zápalových, autoimunitných ochoreniach je teda výraznejšie ako pri malígnych novotvaroch, metabolických poruchách a dedičných léziách.

Zvýšenie syntézy CK je sekundárnym javom, odpoveďou organizmu na pôsobenie patogénnych faktorov. Zvýšenie koncentrácie IL-1β, -2, -6, -8, -12, IF-γ, TNF-α v skorých štádiách a vo výške ochorenia odráža zvýšenie adhezívnej, chemotoxickej, cytotoxickej aktivity , syntéza biologicky účinných látok, proteíny akútnej fázy, voľné radikály. Tieto procesy spôsobujú porušenie mikrocirkulácie, rozvoj hyperémie, edému, nekrobiózy. V neskorších obdobiach dochádza pod vplyvom CK (IF-γ, TNF-α, IL-6, -4, -10) k fagocytóze poškodených buniek, využitiu deštruktívneho materiálu, procesov regenerácie, angiogenézy, obnovy epiteliálna vrstva, rast vláknité tkanivo. Prostredníctvom uvedených mechanizmov sa CK podieľa na patogenéze DOD, iniciuje a reguluje exsudatívno-alternatívne a kompenzačno-reštauračné procesy v tkanivách gastrointestinálneho traktu, pričom realizuje interakciu medzi imunokompetentnými a rôznymi špecializovanými bunkami. V závislosti od konkrétnych podmienok môžu ústredné výbory zohrávať úlohu oboch faktorov agresie a obrany. Ochranný účinok CK je spojený s aktiváciou vrodenej a získanej imunity, stimuláciou nešpecifickej, prirodzenej rezistencie a špecifickej imunitnej odpovede.

Biologický účinok CK pri pôsobení rôznych patogénnych faktorov (infekčné, toxické, mechanické, tepelné) je určený intenzitou a trvaním antigénnej stimulácie a je charakterizovaný nedostatočnou špecifickosťou. Zvýšenie syntézy CK je univerzálna, nešpecifická odpoveď organizmu na pôsobenie patogénnych činiteľov. Predĺžená, intenzívna syntéza CK, ich nadmerné uvoľňovanie sa môže stať faktorom progresie patologického procesu, ktorý má priamy škodlivý účinok na bunky a tkanivá.

Úloha cytokínov v diagnostike chorôb tráviaceho systému

Zmeny stavu cytokínov v KOD odlišnej etiológie líšia v kvantitatívnych parametroch, nie je možné identifikovať žiadne výrazné kvalitatívne, špecifické znaky. V tomto smere nemožno hovoriť o priamej diagnostickej hodnote stanovenia cytokínového stavu, čo nevylučuje jeho nepriamy význam. Napríklad zvýšenie koncentrácie prozápalového CK v žlči naznačuje prítomnosť zápalového procesu v žlčníka. Stanovenie stavu cytokínov pri MDO má však významnú prognostickú hodnotu, keďže hladina prozápalových a protizápalových CK, ich pomer odzrkadľuje intenzitu alteratívno-deštruktívnych a regeneračno-reštauračných procesov, ich dynamiku a progresiu ochorenia.

Základná liečba podávaná pacientom s exacerbáciami chronickej MDO je u väčšiny pacientov sprevádzaná výrazným poklesom zvýšených sérových koncentrácií CK v porovnaní s hladinou pred liečbou. Tieto údaje odrážajú pozitívnu dynamiku ukazovateľov klinickej a laboratórnej aktivity ochorenia, imunitného stavu a účinnosti použitej terapie. Pokračujúci nárast obsahu prozápalových CK (predovšetkým TNF-α) na pozadí prebiehajúcej terapie naznačuje absenciu výrazných pozitívnych zmien, progresiu patologického procesu.

Cytokínová terapia

Úspechy modernej molekulárnej biológie, biotechnológie, imunológie a genetiky pri štúdiu štruktúrnej organizácie a funkčných vlastností CK slúžia ako základ pre ich využitie na terapeutické účely pri ochoreniach rôznych orgánov a systémov.

CK sa môže použiť ako substitučná, stimulačná alebo inhibičná terapia pre funkčnú aktivitu imunitného systému. Terapeutické pôsobenie mnohých CK je spôsobená ich schopnosťou zvyšovať celkovú reaktivitu organizmu, nešpecifickú ochranu a špecifickú imunitu a mať antivírusový, antibakteriálny, antitoxický účinok. Indikáciou substitučnej, kompenzačnej terapie CK je zníženie ich obsahu, sekundárne imunodeficitné stavy, ktoré sa často vyskytujú pri chronických progresívnych infekčných, zápalových, autoimunitných ochoreniach.

Pozitívne výsledky boli zaznamenané pri použití rekombinantných prípravkov interferónov, interleukínov, ktoré aktivujú lokálnu a systémovú imunitu. V súčasnosti sa získal rozsiahly faktografický materiál týkajúci sa terapeutického účinku prípravkov rekombinantného interferónu-a (roferon A, reaferon, intrón A) používaných ako univerzálne nešpecifické antivírusové činidlo, najmä pri vírusovej hepatitíde. V Ústrednom výskumnom ústave gastroenterologickom sa používa kombinovaná antivírusová liečba u pacientov s chronickou vírusovou hepatitídou C vrátane rekombinantné lieky interferón-α 2 domácej produkcie, bol sprevádzaný pozitívnou dynamikou ukazovateľov klinickej, histologickej, biochemickej, virologickej aktivity, imunitného stavu.

Silným aktivátorom prirodzenej rezistencie sú prípravky INF-α, induktory jeho syntézy (cykloferón, amixín), stimulujúce nešpecifickú ochranu, cytotoxickú, fagocytárnu aktivitu, čím prispievajú k deštrukcii a odstráneniu infikovaných, nádorových a iných defektných buniek z tela. .

V prípadoch pretrvávajúceho zvýšenia syntézy CK pri chronických progresívnych ochoreniach sa používajú inhibítory a antagonisty CK. Patria sem najmä lieky s obsahom monoklonálnych protilátok proti TNFα (infliximab). Intravenózne podanie infliximab pacientom s nešpecifickou ulceróznou kolitídou, Crohnovou chorobou, ktorí boli hospitalizovaní v Ústrednom výskumnom ústave gastroenterológie, sprevádzala výrazná zmena stavu cytokínov: pokles obsahu periférnej krvi nielen TNF-α (zo 110 na 55 pg/ml), ale aj IL-6 (so 60 až 30 pg/ml), pri súčasnom zvýšení koncentrácie IL-12 (z 90 na 210 pg/ml), bez výraznejšej zmeny hladiny IL-4.

Použitie CK, ich induktorov a inhibítorov je teda sprevádzané zlepšením klinickej a laboratórnej aktivity, znížením intenzity zápalových, imunopatologických reakcií pri chronickej MDO, pozitívny efekt je však dočasný.

Záver

Zmeny v cytokínovom stave v KOD sú vyjadrené v rôznej miere v závislosti od etiologického faktora, možností priebehu, trvania, štádia, aktivity ochorenia, terapie. Maximálne, relatívne krátkodobé zvýšenie obsahu širokého spektra CK v periférnej krvi, odrážajúce dynamiku patologického procesu, je charakteristické pre exacerbácie chronickej recidivujúcej MDO. Predĺžené, monotónne, stredne výrazné zvýšenie koncentrácie kľúčových pro- a protizápalových CK sa zaznamenalo pri progresívnej KOD. Základná terapia PDO je sprevádzaná poklesom zvýšeného obsahu CK pri súčasnej pozitívnej dynamike klinických a laboratórnych ukazovateľov aktivity ochorenia.

Stanovenie cytokínového stavu má významnú prognostickú hodnotu, pretože umožňuje posúdiť intenzitu zápalových, infekčných, imunopatologických procesov, ich dynamiku, progresiu MAD, ako aj účinnosť terapie.

Literatúra

1. Ljašenko A.A., Uvarov V.Yu. K otázke systematizácie cytokínov//Pokroky v modernej biológii.- 2001.- 121.- č.6.- S. 589–603.

2. Chereshnev V.A., Gusev E.I. Imunológia zápalu: úloha cytokínov// Med. imunológia.- 2001.- v. 3.- č. 3.- S. 361–368.

3. Roit A., Brostoff J., Mail D. Immunology.- M.: Mir, 2000.- S. 169–175.

4. Adler Guido. Crohnova choroba a ulcerózna kolitída - M.: Medicína, 2001. - 64 s.

5. Andersen L., Norgard A., Bennedsen M. Bunková imunitná odpoveď na infekciu N.R. / V knihe: Helicobacter pylori: revolúcia v gastroenterológii.- M., 1999.- S. 46–53.

6. Astakhin A.V., Levitan B.N., Dudina O.S. a kol. Regulačné cytokíny v krvnom sére chronická hepatitída a cirhóza pečene // Ros. časopis gastroenterol., hepatol., koloprotol.- 2002.- 12.- 5.- str.80.

7. Gudkova R.B., Zhukova S.G., Krums L.M. Sérové ​​cytokíny pri celiakii // Ros. gastroenter. časopis - 2001. - Číslo 2. - S. 121.

8. Zhukova E.N. Sérový interleukín 8 v rôznych obdobiach chronickej recidivujúcej pankreatitídy a jeho účasť na patogenéze ochorenia // Ross. gastroenterol. časopis - 2000. - č. 1. - S. 15–18.

9. Kondrashina E.A., Kalinina N.M., Davydova N.I., Baranovsky A.Yu., Kondrashin A.S. Vlastnosti cytokínového profilu u pacientov s chronickou gastritídou a peptickým vredom súvisiacim s H. pylory // Cytokíny a zápal - 2002. - zväzok 1. - č. 4. - s. 3–11.

10. Lazebnik L.B., Tsaregorodtseva T.M., Serova T.I. a kol. Cytokíny a cytokínová terapia pri ochoreniach tráviaceho systému// Ter. arch.- 2004.- č.4.- S. 69–72.

11. Tsaregorodtseva T.M., Serova T.I. Cytokíny v gastroenterológii.- M.: Anacharsis, 2003.- 96 s.

12. Tsaregorodtseva T.M., Vinokurova L.V., Zhivaeva N.S. Stav cytokínov pri chronickej pankreatitíde alkoholickej a biliárnej etiológie// Ter. arch.- 2006.- č. 2.- S. 57–60.

13. Loginov A.S., Tsaregorodtseva T.M., Serova T.I. a kol. Interleukíny pri chronickej vírusovej hepatitíde// Ter. arch.- 2001.- č.2.- S. 17–20.

14. Pavlenko V.V. Interleukín-1b a regeneračná aktivita sliznice hrubého čreva v ulcerózna kolitída// Ros. časopis gastroenter., hepatol., koloprokol.- 2002.- v. XII.- č.5.- str. 58.

15. Semenenko T.A. Bunková imunitná odpoveď pri hepatitíde C// Vírusová hepatitída.- 2000.- č. 1.- (8).- S. 3–9.

16. Sokolová G.N., Tsaregorodtseva T.M., Zotina M.M., Dubtsova E.A. Interleukíny at peptický vredžalúdka a dvanástnika// Ros. gastroenterol. časopis - 2001. - č. 2. - S. 147–148.

17. Tkachenko E.I., Eremina E.I. Niekoľko komentárov k súčasnému stavu problematiky peptického vredu / / Gastroenterológia - Petrohrad - 2002 - č. 1. - S. 2–5.

18. Trukhan D.I. Klinické a imunologické varianty priebehu chronickej pankreatitídy// Ter. arch.- 2001.- č.2.- S. 20–23.

19. Sherlock S., Dully J. Choroby pečene a žlčových ciest. M.: Medicína, 1999.- S. 92–95.

20. Shichkin V.P. Patogenetický význam cytokínov a perspektívy cytokínovej / anticytokínovej terapie / / Imunológia - 1998. - č. 2. - S. 9–13.

21. Zmyzgova A.V. Interferónová terapia vírusovej hepatitídy.- M., 1999.

22. Dolgushina A.I. Beta-leukín v liečbe peptického vredu// Cytokíny a zápal.- 2002.- zväzok 1.- č. 2.- str. 34.

23. Moskalev A.V., Golofeevsky V.Yu., Botieva V.I. a kol. Korekcia porúch cytokínového stavu beta-leukínom u pacientov s chronickými eróziami žalúdka.

24. Panina A.A., Antonov Yu.V., Nedogoda V.V. Skúsenosti s použitím Roncoleukinu u pacientov s chronickou vírusovou hepatitídou B// Med. imunológia.- Petrohrad.- 2002.- 4.- 2.- S. 370–371.

25. Sklyar L.F., Markelová E.V. Cytokínová terapia rekombinantným interleukínom 2 (Roncoleukin) u pacientov s chronickou vírusovou hepatitídou C// Cytokíny a zápal.- 2002.- ročník 1.- č. 4.- str. 43–46.

26. Ilchenko L.Yu., Tsaregorodtseva T.M. Interferóny a interferónová terapia pri chronickej vírusovej hepatitíde//Experiment. a klinické gastroenterol.- 2003.- č.1.- S. 126.

27. Mammaev S.N., Lukina E.A., Ivashkin V.T. a kol. Produkcia cytokínov u pacientov s chronickou vírusovou hepatitídou C počas liečby interferónom// Klinické. laboratórium Diagnostika.- 2001.- č.8.- S. 45–47.

28. Panaccione R., Ricart E., Sandborn W.J. a kol. Infliximab pre Crohnovu chorobu v klinickej praxi na Mayo Clinic// Am..J.Gastroenterol..- 2001.-96.- S. 722–729.

29. Sandborn W.J., Hanauer S.B. Infliximab v liečbe Chrohnovej choroby// Am.J.Gastroenterol.- 2002.-v. 97.- Číslo 12.- S. 2962–2972.

30. Tremaine W.I., Sands B.E., Rutgeerts P.J. a kol. Infliximab v liečbe ťažkej ulceróznej kolitídy refraktérnej na steroidy// J.B.D.- 2001.- 7.- S. 83–88.

31. Wagner C., Cornillie F., Shealy D. a kol. Infliximab vyvolal silnú protizápalovú a lokálnu imunomodulačnú aktivitu, ale žiadnu systémovú imunosupresiu u pacientov s Crohnovou chorobou// Aliment. Pharmacol. Ther.- 2001.- 15.- S. 463–473.

32. Belousová E.A. Infliximab - nová etapa v liečbe Crohnovej choroby // Farmateka - 2002. - č. 9. - S. 17–25.

Čeľabinská štátna univerzita

Na tému: "Cytokíny"

Doplnil: Ustyuzhanina D.V.

Skupina BB 202-1

Čeľabinsk

Všeobecná charakteristika cytokínov

Mechanizmus účinku cytokínov

Mechanizmus porušenia

interleukíny

Interferóny

TNF: Faktor nekrózy nádorov

faktory stimulujúce kolónie

1. Cytokíny

Cytokíny sú špecifické proteíny, pomocou ktorých si rôzne bunky imunitného systému môžu navzájom vymieňať informácie a koordinovať akcie. Súbor a množstvá cytokínov pôsobiacich na receptory bunkového povrchu – „cytokínové prostredie“ – predstavujú matricu interagujúcich a často sa meniacich signálov. Tieto signály sú zložité kvôli širokej škále cytokínových receptorov a pretože každý cytokín môže aktivovať alebo inhibovať niekoľko procesov, vrátane vlastnej syntézy a syntézy iných cytokínov, ako aj tvorby a výskytu cytokínových receptorov na bunkovom povrchu. Rôzne tkanivá majú svoje zdravé „cytokínové prostredie“. Bolo nájdených viac ako sto rôznych cytokínov.

Cytokíny sa líšia od hormónov tým, že ich neprodukujú endokrinné žľazy, ale rôzne typy buniek; Okrem toho kontrolujú oveľa širšie spektrum cieľových buniek ako hormóny.

Cytokíny zahŕňajú niektoré rastové faktory ako naprinterferónyfaktor nekrózy nádorov (TNF) , riadokinterleukínyfaktor stimulujúci kolónie (CSF) a veľa ďalších.

Cytokíny zahŕňajú interferóny, faktory stimulujúce kolónie (CSF), chemokíny, transformujúce rastové faktory; faktor nekrózy nádorov; interleukíny so stanovenými historickými sériovými číslami a niektoré ďalšie endogénne mediátory. Interleukíny so sériovými číslami začínajúcimi od 1 nepatria do jednej podskupiny cytokínov spojených so spoločnou funkciou. Tie možno zase rozdeliť na prozápalové cytokíny, rastové a diferenciačné faktory lymfocytov a jednotlivé regulačné cytokíny.

Klasifikácia štruktúry:

Funkčná klasifikácia:

Klasifikácia cytokínových receptorov

Štruktúrna a funkčná klasifikácia cytokínov

Všeobecné vlastnosti cytokínov:

1. Cytokíny sú polypeptidy alebo proteíny, často glykozylované, väčšina z nich má MM od 5 do 50 kDa. Biologicky aktívne cytokínové molekuly môžu pozostávať z jednej, dvoch, troch alebo viacerých rovnakých alebo rôznych podjednotiek. 2. Cytokíny nemajú antigénnu špecifickosť biologického účinku. Ovplyvňujú funkčnú aktivitu buniek zapojených do reakcií vrodenej a získanej imunity. Napriek tomu sú cytokíny pôsobením na T- a B-lymfocyty schopné stimulovať antigénom indukované procesy v imunitnom systéme. 3. Pre cytokínové gény existujú tri varianty expresie: a) štádium špecifická expresia v určitých štádiách embryonálneho vývoja, b) konštitutívna expresia na reguláciu množstva normálnych fyziologických funkcií, c) indukovateľný typ expresie, charakteristický pre väčšina cytokínov. V skutočnosti väčšina cytokínov mimo zápalovej reakcie a imunitnej reakcie nie je syntetizovaná bunkami. Expresia cytokínových génov začína ako odpoveď na prienik patogénov do tela, antigénne podráždenie alebo poškodenie tkaniva. Molekulárne štruktúry spojené s patogénom slúžia ako jeden z najsilnejších induktorov syntézy prozápalových cytokínov. Na spustenie syntézy cytokínov T-buniek je potrebná aktivácia buniek špecifickým antigénom za účasti antigénového receptora T-buniek. 4. Cytokíny sa syntetizujú v reakcii na stimuláciu počas krátkeho časového obdobia. Syntéza je ukončená rôznymi autoregulačnými mechanizmami, vrátane zvýšenej nestability RNA a existenciou negatívnych spätných väzieb sprostredkovaných prostaglandínmi, kortikosteroidnými hormónmi a inými faktormi. 5. Jeden a ten istý cytokín môžu produkovať rôzne typy buniek histogenetického pôvodu tela v rôzne telá. 6. Cytokíny môžu byť spojené s membránami buniek, ktoré ich syntetizujú, pričom majú celé spektrum biologickej aktivity vo forme membránovej formy a prejavujú svoj biologický účinok počas medzibunkového kontaktu. 7. Biologické účinky cytokínov sú sprostredkované prostredníctvom špecifických bunkových receptorových komplexov, ktoré viažu cytokíny s veľmi vysokou afinitou a jednotlivé cytokíny môžu využívať spoločné receptorové podjednotky. Cytokínové receptory môžu existovať v rozpustnej forme, pričom si zachovávajú schopnosť viazať ligandy. 8. Cytokíny majú pleiotropný biologický účinok. Ten istý cytokín môže pôsobiť na mnoho typov buniek, čo spôsobuje rôzne účinky v závislosti od typu cieľových buniek. Pleiotropný účinok cytokínov je zabezpečený expresiou cytokínových receptorov na bunkových typoch rôzneho pôvodu a funkcií a signálnou transdukciou pomocou niekoľkých rôznych intracelulárnych poslov a transkripčných faktorov. 9. Zameniteľnosť biologického účinku je charakteristická pre cytokíny. Niekoľko rôznych cytokínov môže spôsobiť rovnaký biologický účinok alebo mať podobnú aktivitu. Cytokíny indukujú alebo potláčajú syntézu seba samých, iných cytokínov a ich receptorov. 10. V reakcii na aktivačný signál bunky súčasne syntetizujú niekoľko cytokínov zapojených do tvorby cytokínovej siete. Biologické účinky v tkanivách a na úrovni tela závisia od prítomnosti a koncentrácie iných cytokínov so synergickým, aditívnym alebo opačným účinkom. 11. Cytokíny môžu ovplyvňovať proliferáciu, diferenciáciu a funkčnú aktivitu cieľových buniek. 12. Cytokíny pôsobia na bunky rôznymi spôsobmi: autokrinne – na bunku, ktorá tento cytokín syntetizuje a vylučuje; parakrinné - na bunkách umiestnených v blízkosti produkčnej bunky, napríklad v ohnisku zápalu alebo v lymfoidnom orgáne; endokrinné - vzdialene na bunkách akýchkoľvek orgánov a tkanív po vstupe do obehu. V druhom prípade sa pôsobenie cytokínov podobá pôsobeniu hormónov.

Jeden a ten istý cytokín môžu produkovať bunkové typy tela rôzneho histogenetického pôvodu v rôznych orgánoch a pôsobiť na mnohé typy buniek, čo spôsobuje rôzne účinky v závislosti od typu cieľových buniek.

Tri varianty prejavu biologického účinku cytokínov.

Zdá sa, že tvorba systému regulácie cytokínov sa vyvinula spolu s vývojom mnohobunkových organizmov a bola spôsobená potrebou vytvoriť mediátory medzibunkovej interakcie, ktoré môžu zahŕňať hormóny, neuropeptidy, adhézne molekuly a niektoré ďalšie. V tomto ohľade sú cytokíny najuniverzálnejším regulačným systémom, pretože sú schopné vykazovať biologickú aktivitu na diaľku po sekrécii produkčnou bunkou (lokálne a systémovo), ako aj počas medzibunkového kontaktu, pričom sú biologicky aktívne vo forme membrány. Tento systém cytokínov sa líši od adhéznych molekúl, ktoré plnia užšie funkcie len pri priamom kontakte s bunkou. Súčasne sa cytokínový systém líši od hormónov, ktoré sú syntetizované hlavne špecializovanými orgánmi a pôsobia po vstupe do obehového systému. Úlohu cytokínov v regulácii fyziologických funkcií organizmu možno rozdeliť do 4 hlavných zložiek: 1. Regulácia embryogenézy, znášky a vývoja orgánov vr. orgánov imunitného systému.2. Regulácia niektorých normálnych fyziologických funkcií.3. Regulácia ochranných reakcií organizmu na lokálnej a systémovej úrovni.4. Regulácia procesov regenerácie tkanív.

). Vzhľadom na to, že aktivovali alebo modulovali proliferačné vlastnosti buniek tejto triedy, nazývali sa imunocytokíny. Keď sa zistilo, že tieto zlúčeniny interagujú nielen s bunkami imunitného systému, ich názov sa skrátil na cytokíny, čo zahŕňa aj faktor stimulujúci kolónie (CSF) a mnohé ďalšie (pozri Vazoaktívne látky a zápaly).

Cytokíny (cytokíny) [gr. kitos- nádoba, tu - bunka a kineo- hýbem sa, povzbudzujem] - veľká a rôznorodá skupina malých (molekulová hmotnosť od 8 do 80 kDa) mediátorov proteínovej povahy - intermediárnych molekúl ("komunikačných proteínov") podieľajúcich sa na medzibunkovej signalizácii najmä v imunitnom systéme. Cytokíny zahŕňajú tumor nekrotizujúci faktor, interferóny, množstvo interleukínov atď. Cytokíny, ktoré sú syntetizované lymfocytmi a sú regulátormi proliferácie a diferenciácie, najmä hematopoetických buniek a buniek imunitného systému, sa nazývajú lymfokíny. Termín "cytokíny" navrhol S. Koen a kol. v roku 1974

Všetky bunky imunitného systému majú určité funkcie a pracujú v dobre koordinovanej interakcii, ktorú zabezpečujú špeciálne biologicky aktívne látky – cytokíny – regulátory imunitných reakcií. Cytokíny sú špecifické proteíny, s ktorými si rôzne bunky imunitného systému môžu navzájom vymieňať informácie a koordinovať akcie. Súbor a množstvá cytokínov pôsobiacich na receptory bunkového povrchu – „cytokínové prostredie“ – predstavujú matricu interagujúcich a často sa meniacich signálov. Tieto signály sú zložité kvôli širokej škále cytokínových receptorov a pretože každý cytokín môže aktivovať alebo inhibovať niekoľko procesov, vrátane vlastnej syntézy a syntézy iných cytokínov, ako aj tvorby a výskytu cytokínových receptorov na bunkovom povrchu. Rôzne tkanivá majú svoje zdravé „cytokínové prostredie“. Bolo nájdených viac ako sto rôznych cytokínov.

Cytokíny sú dôležitým prvkom pri interakcii rôznych lymfocytov medzi sebou a s fagocytmi (obr. 4). Práve prostredníctvom cytokínov pomáhajú T-pomocníci koordinovať prácu rôznych buniek zapojených do imunitnej odpovede.

Od objavu interleukínov v 70. rokoch 20. storočia bolo dodnes objavených viac ako sto biologicky aktívnych látok. Rôzne cytokíny regulujú proliferáciu a diferenciáciu imunokompetentných buniek. A zatiaľ čo vplyv cytokínov na tieto procesy bol celkom dobre študovaný, údaje o vplyve cytokínov na apoptózu sa objavili relatívne nedávno. Mali by sa vziať do úvahy aj pri klinickom použití cytokínov.

Medzibunková signalizácia v imunitnom systéme sa uskutočňuje priamou kontaktnou interakciou buniek alebo pomocou mediátorov medzibunkových interakcií. Pri štúdiu diferenciácie imunokompetentných a hematopoetických buniek, ako aj mechanizmov medzibunkových interakcií, ktoré tvoria imunitnú odpoveď, bola objavená veľká a rôznorodá skupina rozpustných mediátorov proteínovej povahy - intermediárnych molekúl („komunikačných proteínov“) zapojených do medzibunkových buniek. signalizácia - cytokíny. Hormóny sú zvyčajne vylúčené z tejto kategórie na základe ich endokrinného (skôr ako parakrinného alebo autokrinného) charakteru ich účinku. (pozri Cytokíny: mechanizmy vedenia hormonálnych signálov). Spolu s hormónmi a neurotransmitermi tvoria základ reči chemickej signalizácie, ktorou sa v mnohobunkovom organizme reguluje morfogenéza a regenerácia tkanív. Hrajú ústrednú úlohu pri pozitívnej a negatívnej regulácii imunitnej odpovede. K dnešnému dňu bolo objavených a študovaných viac ako sto cytokínov u ľudí v rôznej miere, ako je uvedené vyššie, a neustále sa objavujú správy o objavení nových. Pre niektoré boli získané analógy vytvorené genetickým inžinierstvom. Cytokíny pôsobia prostredníctvom aktivácie cytokínových receptorov.

Pomerne často sa rozdelenie cytokínov do niekoľkých rodín neuskutočňuje podľa ich funkcií, ale podľa povahy trojrozmernej štruktúry, ktorá odráža vnútroskupinovú podobnosť v konformácii a sekvencii aminokyselín špecifických bunkových cytokínových receptorov ( pozri "Receptory pre cytokíny"). Niektoré z nich sú produkované T bunkami (pozri "Cytokíny produkované T bunkami"). Hlavnou biologickou aktivitou cytokínov je regulácia imunitnej odpovede vo všetkých štádiách jej vývoja, v ktorej zohrávajú ústrednú úlohu. Vo všeobecnosti celá táto veľká skupina endogénnych regulátorov poskytuje širokú škálu procesov, ako napríklad:

Indukcia cytotoxicity v makrofágoch,

Mnohé závažné ochorenia vedú k výraznému zvýšeniu hladiny IL-1 a TNF-alfa. Tieto cytokíny prispievajú k aktivácii fagocytov, ich migrácii do miesta zápalu, ako aj k uvoľňovaniu zápalových mediátorov - lipidových derivátov, teda prostaglandínu E2, tromboxánov a faktora aktivujúceho krvné doštičky. Okrem toho priamo alebo nepriamo spôsobujú expanziu arteriol, syntézu adhezívnych glykoproteínov, aktivujú T- a B-lymfocyty. IL-1 spúšťa syntézu IL-8, ktorý podporuje chemotaxiu monocytov a neutrofilov a uvoľňovanie enzýmov z neutrofilov. V pečeni je znížená syntéza albumínu a zvýšená syntéza proteínov akútnej fázy zápalu, vrátane inhibítorov proteáz, zložiek komplementu, fibrinogénu, ceruloplazmínu, feritínu a haptoglobínu. Hladina C-reaktívneho proteínu, ktorý sa viaže na poškodené a odumreté bunky, ako aj na niektoré mikroorganizmy, sa môže zvýšiť 1000-krát. Môže tiež dôjsť k významnému zvýšeniu koncentrácie amyloidu A v sére a jeho ukladaniu v rôznych orgánoch, čo vedie k sekundárnej amyloidóze. Najdôležitejším mediátorom akútnej fázy zápalu je IL-6, hoci IL-1 a TNF-alfa môžu tiež spôsobiť opísané zmeny funkcie pečene. IL-1 a TNF alfa zosilňujú vzájomný vplyv na lokálne a celkové prejavy zápalu, takže kombinácia týchto dvoch cytokínov, dokonca aj v malých dávkach, môže spôsobiť zlyhanie viacerých orgánov a pretrvávajúcu arteriálnu hypotenziu. Potlačenie aktivity ktoréhokoľvek z nich túto interakciu eliminuje a výrazne zlepšuje stav pacienta. IL-1 aktivuje T- a B-lymfocyty silnejšie pri 39 °C ako pri 37 °C. IL-1 a TNF-alfa spôsobujú zníženie svalovej hmoty a stratu chuti do jedla, čo vedie ku kachexii s dlhotrvajúcou horúčkou. Tieto cytokíny sa dostanú do krvného obehu len na krátky čas, no na naštartovanie produkcie IL-6 to stačí. IL-6 je neustále prítomný v krvi, takže jeho koncentrácia viac zodpovedá závažnosti horúčky a iným prejavom infekcie. IL-6 sa však na rozdiel od IL-1 a TNF-alfa nepovažuje za letálny cytokín.

Zhrnutie. Cytokíny sú malé proteíny, ktoré pôsobia autokrinne (tj na bunku, ktorá ich produkuje) alebo parakrinne (na blízke bunky). Tvorba a uvoľňovanie týchto vysoko aktívnych molekúl je prechodné a prísne regulované. Cytokíny, ktoré sú syntetizované lymfocytmi a sú regulátormi proliferácie a diferenciácie, najmä hematopoetických buniek a buniek imunitného systému, sa tiež nazývajú lymfokíny a

Cytokíny

Cytokíny

Vlastnosti cytokínov

Pleiotropia cytokínov na príklade interferónu-gama

Typy cytokínovej regulácie

10. Pochopenie cytokínového systému v klinickej praxi

11. Hlavné typy cytokínov - bežné skratky: interleukíny

12. Hlavné typy cytokínov - všeobecne akceptované skratky:

13. Hlavné typy cytokínov - všeobecne akceptované skratky:

14. Hlavné typy cytokínov - všeobecne akceptované skratky:

15. Klasifikácia cytokínov na základe ich biologických účinkov

16. Klasifikácia cytokínov na základe ich úlohy pri regulácii zápalu

17. Cytokíny s regulačnou (protizápalovou) aktivitou

18. 1. Cytokíny vrodenej imunity

19. ROZPOZNANIE PATOGÉNOV IMUNITNÝMI RECEPTORMI

20.

21. Funkčná aktivita prozápalových cytokínov v závislosti od ich koncentrácie – lokálne a systémové pôsobenie

22.

23. Úloha niektorých cytokínov v patogenéze zápalových reakcií: Posilnenie reakcií vrodenej imunitnej odpovede

24. Interleukín-1-beta: vlastnosti

25. Interleukín-1-beta: vlastnosti

26. Biologický význam pôsobenia cytokínov pri systémovom zápale

27.

28. IL-1 a TNF-

29. Rastové faktory

30.

31.

S tuberkulózou; so sarkoidózou, kontaktnou dermatitídou, Crohnovou chorobou)
Th2 - alergický typ odpovede zahŕňajúci histamín a prostaglandíny
T h 17 - neutrofilný zápal
Tfn (folicular T helpers) – humorálna imunitná odpoveď
T reg –T h regulačný (obmedzenie sily všetkých typov imunitnej odpovede a
zápal)

Táto kapitola sa bude zaoberať integrovaným prístupom k hodnoteniu cytokínového systému s použitím skôr opísaných moderných výskumných metód.

Najprv načrtneme základné pojmy cytokínového systému.

Cytokíny sa v súčasnosti považujú za proteín-peptidové molekuly produkované rôznymi bunkami tela, ktoré vykonávajú medzibunkové a medzisystémové interakcie. Cytokíny sú univerzálne regulátory životného cyklu bunky, riadia procesy diferenciácie, proliferácie, funkčnej aktivácie a apoptózy.

Cytokíny produkované bunkami imunitného systému sa nazývajú imunocytokíny; predstavujú triedu rozpustných peptidových mediátorov imunitného systému nevyhnutných pre jeho vývoj, fungovanie a interakciu s inými telesnými systémami (Kovalchuk L.V. et al., 1999).

Ako regulačné molekuly zohrávajú cytokíny významnú úlohu pri realizácii reakcií vrodenej a adaptívnej imunity, zabezpečujú ich vzájomné prepojenie, riadia krvotvorbu, zápaly, hojenie rán, tvorbu nových ciev (angiogenézu) a mnohé ďalšie životne dôležité procesy.

V súčasnosti existuje niekoľko rôznych klasifikácií cytokínov, berúc do úvahy ich štruktúru, funkčnú aktivitu, pôvod a typ cytokínových receptorov. Tradične, v súlade s biologickými účinkami, je zvykom rozlišovať nasledujúce skupiny cytokínov.

1. interleukíny(IL-1-IL-33) - sekrečné regulačné proteíny imunitného systému, zabezpečujúce interakcie mediátorov v imunitnom systéme a jeho prepojenie s inými systémami tela. Interleukíny sa delia podľa funkčnej aktivity na pro- a protizápalové cytokíny, rastové faktory lymfocytov, regulačné cytokíny atď.

3. Faktory nekrózy nádorov (TNF)- cytokíny s cytotoxickými a regulačnými účinkami: TNFa a lymfotoxíny (LT).

4. Rastové faktory hematopoetických buniek- rastový faktor kmeňových buniek (Kit - ligand), IL-3, IL-7, IL-11, erytropoetín, trobopoetín, faktor stimulujúci kolónie granulocytov a makrofágov - GM-CSF, granulocytárny CSF - G-CSF, makrofágy-

ny KSF - M-CSF).

5. Chemokíny- С, СС, СХС (IL-8), СХ3С - regulátory chemotaxie rôznych typov buniek.

6. Rastové faktory nelymfoidných buniek- regulátory rastu, diferenciácie a funkčnej aktivity buniek rôznych tkanivových príslušností (fibroblastový rastový faktor - FGF, endoteliálny bunkový rastový faktor, epidermálny rastový faktor - epidermálny EGF) a transformujúce rastové faktory (TGFβ, TGFα).

Okrem iného sa v posledných rokoch aktívne študoval faktor, ktorý inhibuje migráciu makrofágov (migračný inhibičný faktor - MIF), ktorý je považovaný za neurohormón s cytokínovou a enzýmovou aktivitou (Suslov A.P., 2003; Kovalchuk L.V. et al. ,

Cytokíny sa líšia štruktúrou, biologickou aktivitou a inými vlastnosťami. Avšak spolu s rozdielmi majú cytokíny všeobecné vlastnosti, charakteristické pre túto triedu bioregulačných molekúl.

1. Cytokíny sú spravidla glykozylované polypeptidy so strednou molekulovou hmotnosťou (menej ako 30 kD).

2. Cytokíny sú produkované bunkami imunitného systému a inými bunkami (napríklad endotel, fibroblasty atď.) v reakcii na aktivačný stimul (molekulárne štruktúry spojené s patogénom, antigény, cytokíny atď.) a zúčastňujú sa reakcií vrodenej a adaptívnej imunity, regulujúcej ich silu a trvanie. Niektoré cytokíny sú syntetizované konštitutívne.

3. Sekrécia cytokínov je krátky proces. Cytokíny nepretrvávajú ako vopred vytvorené molekuly, ale skôr

syntéza vždy začína transkripciou génov. Bunky produkujú cytokíny v nízkych koncentráciách (pikogramy na mililiter).

4. Vo väčšine prípadov sú produkované cytokíny a pôsobia na cieľové bunky, ktoré sú v tesnej blízkosti (účinok krátkeho dosahu). Hlavným miestom pôsobenia cytokínov je medzibunková synapsia.

5. Nadbytok Cytokínový systém sa prejavuje v skutočnosti, že každý typ bunky je schopný produkovať niekoľko cytokínov a každý cytokín môže byť vylučovaný rôznymi bunkami.

6. Všetky cytokíny sú charakterizované pleiotropia, alebo multifunkčnosť pôsobenia. Prejav príznakov zápalu je teda spôsobený vplyvom IL-1, TNFα, IL-6, IL-8. Duplikácia funkcií zabezpečuje spoľahlivosť cytokínového systému.

7. Pôsobenie cytokínov na cieľové bunky je sprostredkované vysoko špecifickými membránovými receptormi s vysokou afinitou, čo sú transmembránové glykoproteíny, zvyčajne pozostávajúce z viac ako jednej podjednotky. Extracelulárna časť receptorov je zodpovedná za väzbu cytokínov. Existujú receptory, ktoré eliminujú prebytočné cytokíny v patologickom zameraní. Ide o takzvané návnadové receptory. Rozpustné receptory sú extracelulárna doména membránového receptora oddelená enzýmom. Rozpustné receptory sú schopné neutralizovať cytokíny, podieľať sa na ich transporte do ohniska zápalu a na vylučovaní z tela.

8. Cytokíny fungovať ako sieť. Môžu konať v zhode. Zdá sa, že mnohé z funkcií pôvodne pripisovaných jedinému cytokínu sú spôsobené spoločným pôsobením niekoľkých cytokínov. (synergizmus akcie). Príkladmi synergickej interakcie cytokínov sú stimulácia zápalových reakcií (IL-1, IL-6 a TNFa), ako aj syntéza IgE

(IL-4, IL-5 a IL-13).

Niektoré cytokíny indukujú syntézu iných cytokínov (kaskáda). Kaskádové pôsobenie cytokínov je nevyhnutné pre rozvoj zápalových a imunitných reakcií. Schopnosť niektorých cytokínov zvyšovať alebo znižovať produkciu iných určuje dôležité pozitívne a negatívne regulačné mechanizmy.

Antagonistický účinok cytokínov je známy, napríklad produkcia IL-6 v reakcii na zvýšenie koncentrácie TNF-a môže byť

negatívny regulačný mechanizmus na kontrolu produkcie tohto mediátora počas zápalu.

Cytokínová regulácia funkcií cieľových buniek sa uskutočňuje pomocou autokrinných, parakrinných alebo endokrinných mechanizmov. Niektoré cytokíny (IL-1, IL-6, TNFα atď.) sú schopné podieľať sa na realizácii všetkých vyššie uvedených mechanizmov.

Reakcia bunky na vplyv cytokínu závisí od niekoľkých faktorov:

Od typu buniek a ich počiatočnej funkčnej aktivity;

Z lokálnej koncentrácie cytokínu;

Z prítomnosti iných mediátorových molekúl.

Produkčné bunky, cytokíny a ich špecifické receptory na cieľových bunkách teda tvoria jedinú sieť mediátorov. Je to súbor regulačných peptidov a nie jednotlivé cytokíny, ktoré určujú konečnú odpoveď bunky. V súčasnosti sa cytokínový systém považuje za tzv univerzálny systém regulácia na úrovni celého organizmu, ktorá zabezpečuje rozvoj ochranných reakcií (napríklad pri infekcii).

V posledných rokoch sa objavila myšlienka cytokínového systému, ktorý kombinuje:

1) produkčné bunky;

2) rozpustné cytokíny a ich antagonisty;

3) cieľové bunky a ich receptory (obr. 7.1).

Porušenie rôznych zložiek cytokínového systému vedie k rozvoju mnohých patologických procesov, a preto je detekcia defektov v tomto regulačnom systéme dôležitá pre správnu diagnózu a určenie adekvátnej terapie.

Najprv zvážime hlavné zložky cytokínového systému.

Bunky produkujúce cytokíny

I. Hlavnou skupinou buniek produkujúcich cytokíny v adaptívnej imunitnej odpovedi sú lymfocyty. Pokojové bunky nevylučujú cytokíny. Po rozpoznaní antigénu a za účasti receptorových interakcií (CD28-CD80/86 pre T-lymfocyty a CD40-CD40L pre B-lymfocyty) dochádza k aktivácii buniek, čo vedie k transkripcii cytokínových génov, translácii a sekrécii glykozylovaných peptidov. do extracelulárneho priestoru.

Ryža. 7.1. Cytokínový systém

CD4 T-helperov predstavujú subpopulácie: Th0, Th1, Th2, Th17, Tfh, ktoré sa navzájom líšia spektrom secernovaných cytokínov v reakcii na rôzne antigény.

Th0 produkuje široké spektrum cytokínov vo veľmi nízkych koncentráciách.

Smer diferenciácie Th0 určuje vývoj dvoch foriem imunitnej odpovede s prevahou humorálnych alebo bunkových mechanizmov.

Smer diferenciácie Th0 reguluje povaha antigénu, jeho koncentrácia, lokalizácia v bunke, typ buniek prezentujúcich antigén a určitý súbor cytokínov.

Dendritické bunky po zachytení a spracovaní antigénu prezentujú antigénne peptidy Th0 bunkám a produkujú cytokíny, ktoré regulujú smer ich diferenciácie na efektorové bunky. Úloha jednotlivých cytokínov v tomto procese je znázornená na obr. 7.2. IL-12 indukuje syntézu IFNy T-lymfocytmi a]ChGK. IFNu zabezpečuje diferenciáciu Th1, ktoré začínajú vylučovať cytokíny (IL-2, IFNu, IL-3, TNFa, lymfotoxíny), ktoré regulujú vývoj reakcií na vnútrobunkové patogény

(precitlivenosť oneskoreného typu (DTH) a odlišné typy bunková cytotoxicita).

IL-4 zabezpečuje diferenciáciu Th0 na Th2. Aktivovaný Th2 produkuje cytokíny (IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, atď.), ktoré podmieňujú proliferáciu B-lymfocytov, ich ďalšiu diferenciáciu na plazmatické bunky a vývoj protilátkových odpovedí, najmä proti extracelulárne patogény.

IFNy negatívne reguluje funkciu Th2 buniek a naopak IL-4, IL-10, vylučované Th2, inhibujú funkciu Th1 (obr. 7.3). Molekulárny mechanizmus tejto regulácie je spojený s transkripčnými faktormi. Expresia T-bet a STAT4, určená pomocou IFNy, riadi diferenciáciu T-buniek pozdĺž dráhy Th1 a potláča vývoj Th2. IL-4 indukuje expresiu GATA-3 a STAT6, čo teda zabezpečuje konverziu naivných Th0 na Th2 bunky (obr. 7.2).

V posledných rokoch bola opísaná odlišná subpopulácia T pomocných buniek (Th17) produkujúcich IL-17. Členovia rodiny IL-17 môžu byť exprimovaní aktivovanými pamäťovými bunkami (CD4CD45RO), y5T bunkami, NKT bunkami, neutrofilmi, monocytmi pod vplyvom IL-23, IL-6, TGFp produkovaných makrofágmi a dendritickými bunkami. ROR-C je hlavným diferenciačným faktorom u ľudí a ROR-y u myší. l Kardinálna úloha IL-17 pri vývoji chronický zápal a autoimunitnej patológie (pozri obr. 7.2).

Okrem toho sa T lymfocyty v týmuse môžu diferencovať na prirodzené regulačné bunky (Treg) exprimujúce povrchové markery CD4+ CD25+ a transkripčný faktor FOXP3. Tieto bunky sú schopné potlačiť imunitnú odpoveď sprostredkovanú Th1 a Th2 bunkami priamym medzibunkovým kontaktom a syntézou TGFβ a IL-10.

Schémy diferenciácie Th0 klonov a nimi vylučovaných cytokínov sú znázornené na obr. 7.2 a 7.3 (pozri aj farebnú prílohu).

T-cytotoxické bunky (CD8+), prirodzení zabijaci – slabí producenti cytokínov, ako sú interferóny, TNFa a lymfotoxíny.

Nadmerná aktivácia jednej z Th subpopulácií môže určiť vývoj jedného z variantov imunitnej odpovede. Chronická nerovnováha aktivácie Th môže viesť k vzniku imunopatologických stavov spojených s prejavmi

mi alergie, autoimunitná patológia, chronické zápalové procesy atď.

Ryža. 7.2. Rôzne subpopulácie T-lymfocytov produkujúcich cytokíny

II. V systéme vrodená imunita Hlavnými producentmi cytokínov sú myeloidné bunky. Pomocou Toll-like receptorov (TLR) rozpoznávajú podobné molekulárne štruktúry rôznych patogénov, takzvané patogénne asociované molekulárne vzory (PAMP), napríklad opakovania atď.

Táto interakcia s TLR spúšťa intracelulárnu signálnu transdukčnú kaskádu vedúcu k expresii génov pre dve hlavné skupiny cytokínov: prozápalový a IFN typu 1 (obr. 7.4, pozri tiež farebnú prílohu). Väčšinou tieto cytokíny (IL-1, -6, -8, -12, TNFa, GM-CSF, IFN, chemokíny atď.) vyvolávajú rozvoj zápalu a podieľajú sa na ochrane tela pred bakteriálnymi a vírusovými infekciami.

Ryža. 7.3. Spektrum cytokínov vylučovaných Th1 a Th12 bunkami

III. Bunky, ktoré nie sú súčasťou imunitného systému (bunky spojivového tkaniva, epitel, endotel) konštitutívne vylučujú autokrinné rastové faktory (GGF, EGF, TGFr atď.). a cytokíny podporujúce proliferáciu hematopoetických buniek.

Cytokíny a ich antagonisty sú podrobne opísané v mnohých monografiách (Kovalchuk L.V. et al., 2000; Ketlinsky S.A., Simbirtsev A.S.,

Ryža. 7.4. TLR-sprostredkovaná indukcia produkcie cytokínov bunkami vrodenej imunity

Nadmerná expresia cytokínov nie je pre telo bezpečná a môže viesť k rozvoju nadmernej zápalovej reakcie, reakcie akútnej fázy. Na regulácii produkcie prozápalových cytokínov sa podieľajú rôzne inhibítory. Bolo teda popísaných množstvo látok, ktoré nešpecificky viažu cytokín IL-1 a zabraňujú prejavom jeho biologického pôsobenia (a2-makroglobulín, C3-zložka komplementu, uromodulín). Špecifickými inhibítormi IL-1 môžu byť rozpustné návnadové receptory, protilátky a antagonista IL-1 receptora (IL-1RA). S rozvojom zápalu dochádza k zvýšeniu expresie génu IL-1RA. Ale aj normálne je tento antagonista prítomný v krvi vo vysokej koncentrácii (až 1 ng / ml alebo viac), čo blokuje pôsobenie endogénneho IL-1.

cieľové bunky

Účinok cytokínov na cieľové bunky je sprostredkovaný špecifickými receptormi, ktoré viažu cytokíny s veľmi vysokou afinitou a jednotlivé cytokíny môžu využívať

spoločné receptorové podjednotky. Každý cytokín sa viaže na svoj špecifický receptor.

Cytokínové receptory sú transmembránové proteíny a delia sa na 5 hlavných typov. Najbežnejší je takzvaný hematopoetický typ receptorov, ktoré majú dve extracelulárne domény, z ktorých jedna obsahuje spoločnú sekvenciu aminokyselinových zvyškov dvoch tryptofánových a serínových opakovaní oddelených ľubovoľnou aminokyselinou (motív WSXWS). Druhý typ receptora môže mať dve extracelulárne domény s veľkým počtom konzervovaných cysteínov. Sú to receptory rodiny IL-10 a IFN. Tretí typ predstavujú cytokínové receptory patriace do skupiny TNF. Štvrtý typ cytokínového receptora patrí do superrodiny imunoglobulínových receptorov, ktoré majú extracelulárne domény podobnú štruktúre ako imunoglobulínové molekuly. Piaty typ receptorov, ktoré viažu molekuly z rodiny chemokínov, predstavujú transmembránové proteíny, ktoré prechádzajú cez bunkovú membránu na 7 miestach. Cytokínové receptory môžu existovať v rozpustnej forme, pričom si zachovávajú schopnosť viazať ligandy (Ketlinsky S.A. et al., 2008).

Cytokíny sú schopné ovplyvňovať proliferáciu, diferenciáciu, funkčnú aktivitu a apoptózu cieľových buniek (pozri obr. 7.1). Prejav biologickej aktivity cytokínov v cieľových bunkách závisí od účasti rôznych vnútrobunkových systémov na prenose signálu z receptora, čo je spojené s charakteristikami cieľových buniek. Signál pre apoptózu sa uskutočňuje okrem iného pomocou špecifickej oblasti rodiny receptorov TNF, takzvanej „smrtiacej“ domény (obr. 7.5, pozri farebnú prílohu). Diferenciačné a aktivačné signály sa prenášajú cez intracelulárne proteíny Jak-STAT - prevodníky signálu a aktivátory transkripcie (obr. 7.6, pozri farebnú prílohu). G-proteíny sa podieľajú na prenose signálu z chemokínov, čo vedie k zvýšenej bunkovej migrácii a adhézii.

Komplexná analýza cytokínového systému zahŕňa nasledujúce.

I. Hodnotenie produkčných buniek.

1. Definícia výrazu:

Receptory, ktoré rozpoznávajú patogén alebo TCR antigén, TLR) na úrovni génov a proteínových molekúl (PCR, metóda prietokovej cytometrie);

Adaptérové ​​molekuly, ktoré vedú signál, ktorý spúšťa transkripciu cytokínových génov (PCR atď.);

Ryža. 7.5. Prenos signálu z TNF receptora

Ryža. 7.6. Jak-STAT - signálna dráha cytokínového receptora 1. typu

cytokínové gény (PCR); proteínové molekuly cytokínov (hodnotenie funkcie syntetizujúcej cytokíny ľudských mononukleárnych buniek).

2. Kvantitatívne stanovenie bunkových subpopulácií obsahujúcich určité cytokíny: Th1, Th2 Th17 (metóda intracelulárneho farbenia cytokínov); stanovenie počtu buniek vylučujúcich určité cytokíny (metóda ELISPOT, pozri kapitolu 4).

II. Hodnotenie cytokínov a ich antagonistov v biologických médiách tela.

1. Testovanie biologickej aktivity cytokínov.

2. Kvantitatívne stanovenie cytokínov pomocou ELISA.

3. Imunohistochemické farbenie cytokínov v tkanivách.

4. Stanovenie pomeru opačných cytokínov (pro- a protizápalových), cytokínov a antagonistov cytokínových receptorov.

III. Hodnotenie cieľových buniek.

1. Stanovenie expresie cytokínových receptorov na úrovni génov a proteínových molekúl (PCR, metóda prietokovej cytometrie).

2. Stanovenie signálnych molekúl v intracelulárnom obsahu.

3. Stanovenie funkčnej aktivity cieľových buniek.

Na získanie rôznych informácií boli vyvinuté mnohé metódy hodnotenia cytokínového systému. Medzi nimi sa rozlišujú:

1) molekulárne biologické metódy;

2) metódy na kvantitatívne stanovenie cytokínov pomocou imunotestu;

3) testovanie biologickej aktivity cytokínov;

4) intracelulárne farbenie cytokínov;

5) metóda ELISPOT, ktorá umožňuje detegovať cytokíny v okolí jednej bunky produkujúcej cytokíny;

6) imunofluorescencia.

Ponúkame stručný popis týchto metód.

Používaním molekulárne biologické metódy je možné študovať expresiu génov cytokínov, ich receptorov, signálnych molekúl, študovať polymorfizmus týchto génov. V posledných rokoch sa uskutočnilo veľké množstvo štúdií, ktoré odhalili asociácie medzi alelovými variantmi génov molekúl cytokínového systému a predispozíciou

na množstvo chorôb. Štúdium alelických variantov cytokínových génov môže poskytnúť informácie o geneticky naprogramovanej produkcii konkrétneho cytokínu. Najcitlivejšia je polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase – PCR-RT (pozri kap. 6). hybridizačná metóda in situ umožňuje objasniť tkanivovú a bunkovú lokalizáciu expresie cytokínových génov.

Kvantitatívne stanovenie cytokínov v biologických tekutinách a v kultúrach mononukleárnych buniek periférnej krvi pomocou ELISA je možné charakterizovať nasledovne. Keďže cytokíny sú lokálne mediátory, je vhodnejšie merať ich hladiny v príslušných tkanivách po extrakcii tkanivových proteínov alebo v prirodzených tekutinách, ako sú slzy, výplachy z dutín, moč, plodová voda, likvor a pod. Hladiny cytokínov v sére alebo iných telesných tekutinách odrážajú aktuálny stav imunitného systému, t.j. syntéza cytokínov bunkami tela in vivo.

Stanovenie hladín produkcie cytokínov mononukleárnymi bunkami periférnej krvi (PBM) ukazuje funkčný stav bunky. Spontánna produkcia cytokínov MNC v kultúre naznačuje, že bunky sú už aktivované. in vivo. Indukovaná (rôznymi stimulantmi, mitogénmi) syntéza cytokínov odráža potenciálnu, rezervnú schopnosť buniek reagovať na antigénny stimul (najmä na pôsobenie liečiv). Znížená indukovaná produkcia cytokínov môže slúžiť ako jeden zo znakov stavu imunodeficiencie. Cytokíny nie sú špecifické pre konkrétny antigén. Preto nie je možná špecifická diagnostika infekčných, autoimunitných a alergických ochorení stanovením hladiny určitých cytokínov. Stanovenie hladín cytokínov zároveň umožňuje získať údaje o závažnosti zápalového procesu, jeho prechode na systémovú úroveň a prognóze, funkčnej aktivite buniek imunitného systému, pomere Th1 a Th2 buniek, čo je veľmi dôležité pri diferenciálnej diagnostike množstva infekčných a imunopatologických procesov.

V biologických médiách môžu byť cytokíny kvantifikované použitím rozsahu imunotestovacie metódy, pomocou polyklonálnych a monoklonálnych protilátok (pozri kapitolu 4). ELISA vám umožňuje zistiť, aké sú presné koncentrácie cytokínov v bio-

logické telesné tekutiny. Detekcia cytokínov ELISA má oproti iným metódam množstvo výhod (vysoká citlivosť, špecifickosť, nezávislosť od prítomnosti antagonistov, možnosť presného automatizovaného účtovania, štandardizácia účtovania). Táto metóda má však aj svoje obmedzenia: ELISA necharakterizuje biologickú aktivitu cytokínov a môže poskytnúť falošné výsledky v dôsledku skrížene reagujúcich epitopov.

biologické testovanie realizované na základe poznania základných vlastností cytokínov, ich pôsobenia na cieľové bunky. Štúdium biologických účinkov cytokínov viedlo k vývoju štyroch typov testovania cytokínov:

1) indukciou proliferácie cieľových buniek;

2) cytotoxickým účinkom;

3) indukciou diferenciácie progenitorov kostnej drene;

4) antivírusovým pôsobením.

IL-1 je určený stimulačným účinkom na proliferáciu myších tymocytov aktivovaných mitogénom in vitro; IL-2 - podľa schopnosti stimulovať proliferatívnu aktivitu lymfoblastov; na cytotoxické účinky na myšie fibroblasty (L929), sa testujú TNFa a lymfotoxíny. Faktory stimulujúce kolónie sa hodnotia podľa ich schopnosti podporovať rast progenitorov kostnej drene ako kolónií na agare. Antivírusová aktivita IFN sa deteguje inhibíciou cytopatického pôsobenia vírusov v kultúre diploidných ľudských fibroblastov a nádorovej línie myších fibroblastov L-929.

Boli vytvorené bunkové línie, ktorých rast závisí od prítomnosti určitých cytokínov. V tabuľke. 7.1 je zoznam bunkových línií používaných na testovanie cytokínov. Podľa schopnosti vyvolať proliferáciu citlivých cieľových buniek sa vykonáva biotestovanie IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15 atď. nie sú príliš citlivé a informatívne. Molekuly inhibítora a antagonistu môžu maskovať biologickú aktivitu cytokínov. Niektoré cytokíny vykazujú všeobecnú biologickú aktivitu. Napriek tomu sú tieto metódy ideálne na testovanie špecifickej aktivity rekombinantných cytokínov.

Tabuľka 7.1. Bunkové línie používané na testovanie biologickej aktivity cytokínov

Koniec tabuľky. 7.1

Laboratórium 7-1

Stanovenie biologickej aktivity IL-1 jeho komitogénnym účinkom na proliferáciu myších tymocytov

Spôsob biologického testovania IL-1 je založený na schopnosti cytokínu stimulovať proliferáciu myších tymocytov.

IL-1 možno stanoviť v kultúre monocytov stimulovaných LPS, ako aj v akejkoľvek telesnej tekutine. Je potrebné dbať na množstvo detailov.

1. Na testovanie sa používajú tymocyty myší C3H/HeJ stimulované k proliferácii mitogénmi (konkanavalín A - ConA a fytohemaglutinín - PHA). Tymocyty C3H/HeJ neboli vybrané náhodne: myši tejto inbrednej línie nereagujú na LPS, ktorý môže byť prítomný v testovanom materiáli a spôsobiť produkciu IL-1.

2. Tymocyty reagujú na IL-2 a mitogény, preto by sa v prípravkoch testovaných na IL-1 mala stanoviť aj prítomnosť IL-2 a mitogénov.

Operačný postup

1. Získajte suspenziu tymocytov v koncentrácii 12×106/ml média RPMI 1640 obsahujúceho 10 % séra plodových kráv a 2-merkaptoetanol (5×10-5 M).

2. Pripraví sa séria po sebe idúcich dvojnásobných riedení experimentálnych (telesných tekutín) a kontrolných vzoriek. Ako kontroly sa používajú biologické tekutiny obsahujúce IL-1 alebo vzorky získané inkubáciou mononukleárnych buniek bez LPS a laboratórny štandardný prípravok obsahujúci IL-1. V 96-jamkových doštičkách s guľatým dnom sa 50 ul každého riedenia prenesie do 6 jamiek.

3. Pridajte 50 ul purifikovaného PHA (Wellcome) rozpusteného v kompletnom médiu v koncentrácii 3 ug/ml do troch jamiek každého riedenia a 50 ul média do ďalších 3 jamiek.

4. Pridajte 50 µl tymocytovej suspenzie do každej jamky a inkubujte 48 hodín pri 37 °C.

6. Pred dokončením kultivácie sa do jamiek pridá 50 μl roztoku (1 μCi / ml) [" 3H]-tymidínu a inkubuje sa ďalších 20 hodín.

7. Na stanovenie úrovne rádioaktivity sa kultivačné bunky prenesú na filtračný papier pomocou automatického zberača buniek, filtre sa vysušia a pomocou kvapalinového scintilačného počítača sa určí prítomnosť značky.

8. Výsledky sú vyjadrené ako stimulačný koeficient.

kde m cp je priemerný počet impulzov v 3 otvoroch.

Ak tymocyty reagujú na stimuláciu štandardným IL-1, potom stimulačný index testovanej vzorky presahujúci 3 spoľahlivo indikuje aktivitu IL-1.

Biotest je jedinou metódou na hodnotenie funkcie cytokínov, ale túto metódu by mali byť doplnené rôznymi vhodnými kontrolami na špecifickosť s použitím monoklonálnych protilátok. Pridanie určitých monoklonálnych protilátok k cytokínu v kultúre blokuje biologickú aktivitu cytokínu, čo dokazuje, že signálom pre proliferáciu bunkovej línie je stanovený cytokín.

Použitie biologického testu na detekciu interferónu. Princíp hodnotenia biologickej aktivity IFN je založený na jeho antivírusovom účinku, ktorý je určený stupňom inhibície reprodukcie testovaného vírusu v bunkovej kultúre.

V práci môžu byť použité bunky citlivé na pôsobenie IFN: pôvodne trypsinizované kuracie a ľudské embryonálne fibroblastové bunky, transplantované bunky ľudských diploidných fibroblastov a myšacie bunkové kultúry (L929).

Pri hodnotení antivírusového účinku IFN je vhodné použiť vírusy s krátkym reprodukčným cyklom, vysokou citlivosťou na pôsobenie IFN: vírus myšacej encefalomyelitídy, myšacia vezikulárna stomatitída a pod.

Laboratórium 7-2

Stanovenie aktivity interferónu

1. Suspenzia diploidných ľudských fetálnych fibroblastov na médiu s 10 % sérom hovädzích embryí (koncentrácia buniek - 15-20 x 10 6 /ml) sa naleje do sterilných 96-jamkových platní s plochým dnom, 100 μl na jamku a umiestni sa v CO2-inkubátore pri teplote 37 °C.

2. Po vytvorení kompletnej monovrstvy sa z jamiek odstráni rastové médium a do každej jamky sa pridá 100 ul udržiavacieho média.

3. Titrácia aktivity IFN v testovaných vzorkách sa uskutočňuje metódou dvojitého riedenia na monovrstve fibroblastov.

Súčasne so vzorkami sa do jamiek zavedie vírus myšacej encefalomyelitídy (MEM) v dávke, ktorá spôsobí 100 % poškodenie buniek 48 hodín po infekcii.

4. Ako kontroly sa použijú jamky s intaktnými (neošetrenými) bunkami infikovanými vírusom.

Referenčné vzorky IFN so známou aktivitou sa používajú ako referenčné prípravky v každej štúdii.

5. Doštičky na riedenie vzoriek sa inkubujú 24 hodín pri 37 °C v atmosfére 5 % C02.

6. Úroveň aktivity IFN je určená recipročnou hodnotou maximálneho riedenia testovanej vzorky, ktorá oneskoruje cytopatický účinok vírusu o 50 %, a vyjadruje sa v jednotkách aktivity na 1 ml.

7. Na určenie typu IFN sa do systému pridá antisérum proti IFNα, IFNβ alebo IFNγ. Antisérum ruší pôsobenie príslušného cytokínu, čo umožňuje identifikovať typ IFN.

Stanovenie biologickej aktivity migrácie inhibičného faktora. V súčasnosti sa vytvorili úplne nové predstavy o povahe a vlastnostiach MÝTU, objaveného v 60. rokoch minulého storočia ako sprostredkovateľa bunkovej imunity a dlhé roky ponechaného bez náležitej pozornosti (Bloom B.R., Bennet B., 1966; David J.R. , 1966). Až za posledných 10-15 rokov sa ukázalo, že MÝTUS je jedným z najdôležitejších biologických mediátorov v tele so širokým spektrom biologických funkcií cytokínu, hormónu a enzýmu. Pôsobenie MIF na cieľové bunky sa realizuje cez CD74 - receptor alebo cez neklasickú dráhu endocytózy.

MYTH je považovaný za dôležitý zápalový mediátor, ktorý aktivuje funkciu makrofágov (tvorba cytokínov, fagocytóza, cytotoxicita atď.), ako aj endogénny imunoregulačný hormón, ktorý moduluje aktivitu glukokortikoidov.

Čoraz viac informácií sa hromadí o úlohe MÝTU v patogenéze mnohých zápalové ochorenia vrátane sepsy, reumatoidnej artritídy (RA), glomerulonefritídy atď. Pri RA je koncentrácia MIF v tekutine postihnutých kĺbov významne zvýšená, čo koreluje so závažnosťou ochorenia. Pod vplyvom MIF sa zvyšuje produkcia prozápalových cytokínov makrofágmi aj synoviálnymi bunkami.

Na testovanie aktivity MIF existujú rôzne metódy, keď sa migrujúce bunky (cieľové bunky pre MIF) umiestnia do sklenenej kapiláry (kapilárny test), do kvapky agarózy alebo do agarózovej jamky.

Predstavujeme relatívne jednoduchú metódu skríningu založenú na tvorbe bunkových mikrokultúr (leukocytov alebo makrofágov) štandardných v ploche a počte buniek na dne jamiek 96-jamkovej platne s plochým dnom, po ktorej nasleduje ich kultivácia v živnom médiu a stanovenie zmeny v oblasti týchto mikrokultúr pôsobením MIF (Suslov A.P., 1989).

Laboratórium 7-3

Definícia činnosti MÝTU

Stanovenie biologickej aktivity MIF sa uskutočňuje pomocou zariadenia na tvorbu bunkových mikrokultúr (obr. 7.7) - MIGROSCRIN (Výskumný ústav epidemiológie a mikrobiológie pomenovaný po N.F. Gamaleya z Ruskej akadémie lekárskych vied).

1. Do jamiek 96-jamkovej platne (Flow, UK alebo podobne) pridajte 100 µl vzorky zriedenej v kultivačnom médiu, v ktorom je stanovená aktivita MIF (každé riedenie v 4 paralelách, experimentálne vzorky). Kultivačné médium obsahuje RPMI 1640, 2 mM L-glutamín, 5 % fetálne hovädzie sérum, 40 ug/ml gentamicínu.

2. Do kontrolných jamiek pridajte kultivačné médium (v 4 paralelách) 100 µl.

3. Pripraví sa bunková suspenzia peritoneálnych makrofágov, pre ktorú sa 2 hybridným myšiam (CBAxC57B1 / 6) F1 intraperitoneálne vstrekne 10 ml Hankovho roztoku s heparínom (10 U / ml), brucho sa jemne masíruje 2-3 minúty . Potom sa zviera usmrtí dekapitáciou, brušná stena sa opatrne prepichne v oblasti slabín a exsudát sa odsaje cez ihlu injekčnou striekačkou. Bunky peritoneálneho exsudátu sa dvakrát premyjú Hankovým roztokom a centrifugujú sa 10 až 15 minút pri 200 g. Potom sa pripraví bunková suspenzia s koncentráciou 10 ± 1 milión/ml média RPMI 1640. Počítanie sa uskutoční v Goryaevovej komore.

4. Zostavte systém MIGROSCRIN, čo je stojan na smerovú a štandardnú fixáciu hrotov s bunkových kultúr v striktne vertikálnej polohe v danej výške nad stredom jamky 96-jamkovej kultivačnej doštičky a obsahuje aj 92 špičiek pre automatickú pipetu z Costar, USA (obr. 7.7).

Vložte nohy statívu do rohových jamiek taniera. Bunková suspenzia sa odoberá automatickou pipetou do špičiek - každá po 5 μl, opláchne sa od prebytočných buniek jediným ponorením do média a vloží sa vertikálne do objímok stojana systému. Naplnený stojan s hrotmi sa udržiava pri izbovej teplote počas 1 hodiny na striktne vodorovnom povrchu. Počas tejto doby sa bunky suspenzie usadia na dne jamiek, kde sa vytvoria štandardné bunkové mikrokultúry.

5. Opatrne vyberte stojan na špičky z platne. Platnička s mikrokultiváciou buniek sa umiestni v striktne horizontálnej polohe do CO 2 inkubátora, kde sa kultivuje 20 hodín.Pri kultivácii bunky migrujú po dne jamky.

6. Kvantifikácia výsledkov po inkubácii sa vykonáva na binokulárnej lupe, pričom sa vizuálne hodnotí veľkosť kolónie na stupnici vo vnútri okuláru. Mikrokultúry majú tvar kruhu. Výskumníci potom určia priemerný priemer kolónie z výsledkov meraní kolónií v 4 experimentálnych alebo kontrolných jamkách. Chyba merania je ±1 mm.

Migračný index (MI) sa vypočíta podľa vzorca:

Vzorka má aktivitu MYTH, ak sa hodnoty MI rovnajú

Pre konvenčnú jednotku (U) aktivity MYTH sa berie prevrátená hodnota rovnajúca sa hodnote najvyššieho zriedenia vzorky (vzorky), pri ktorej je migračný index 0,6 ± 0,2.

Biologická aktivita PEOα sa odhaduje podľa jeho cytotoxického účinku na líniu transformovaných fibroblastov L-929. Rekombinantný TNFa sa používa ako pozitívna kontrola a bunky v kultivačnom médiu sa používajú ako negatívna kontrola.

Cytotoxický index (CI) sa vypočíta:

kde a- počet živých buniek v kontrole; b- počet živých buniek v pokuse.

Ryža. 7.7. Schéma MIGROSCRIN - zariadenia na kvantitatívne hodnotenie migrácie bunkových kultúr

Bunky sú zafarbené farbivom (metylénová modrá), ktoré je obsiahnuté iba v odumretých bunkách.

Pre konvenčnú jednotku aktivity TNF sa berie hodnota reverzného riedenia vzorky, ktorá je potrebná na získanie 50 % bunkovej cytotoxicity. Špecifická aktivita vzorky je pomer aktivity v ľubovoľných jednotkách na 1 ml ku koncentrácii proteínu obsiahnutého vo vzorke.

Intracelulárne farbenie cytokínov. Zmena v pomere buniek produkujúcich rôzne cytokíny môže odrážať patogenézu ochorenia a slúžiť ako kritérium prognózy ochorenia a hodnotenia terapie.

Metóda intracelulárneho farbenia určuje expresiu cytokínu na úrovni jednej bunky. Prietoková cytometria vám umožňuje spočítať počet buniek exprimujúcich konkrétny cytokín.

Uveďme hlavné kroky pri stanovení intracelulárnych cytokínov.

Nestimulované bunky produkujú malé množstvá cytokínov, ktoré sa preto zvyčajne neukladajú míľnikom hodnotenie intracelulárnych cytokínov je stimulácia lymfocytov a blokáda uvoľňovania týchto produktov z buniek.

Ako induktor cytokínov sa najčastejšie používa aktivátor proteínkinázy C forbol-12-myristát-13-acetát (PMA) v kombinácii s kalciovým ionoforom ionomycínom (IN). Použitie tejto kombinácie spôsobuje syntézu širokého spektra cytokínov: IFNu, IL-4, IL-2, TNFα. Nevýhodou použitia FMA-IN je problém detekcie molekúl CD4 na povrchu lymfocytov po takejto aktivácii. Tiež produkcia cytokínov T-lymfocytmi je indukovaná pomocou mitogénov (PGA). B bunky a monocyty stimulujú

Mononukleárne bunky sa inkubujú v prítomnosti induktorov produkcie cytokínov a blokátora ich vnútrobunkového transportu, brefeldínu A alebo monenzínu, počas 2-6 hodín.

Bunky sa potom resuspendujú v tlmivom roztoku. Na fixáciu pridajte 2% formaldehyd, inkubujte 10-15 minút pri izbovej teplote.

Potom sa bunky ošetria saponínom, ktorý zvyšuje permeabilitu bunkovej membrány, a zafarbia sa monoklonálnymi protilátkami špecifickými pre stanovované cytokíny. Predbežné farbenie povrchových markerov (CD4, CD8) zvyšuje množstvo získaných informácií o bunke a umožňuje presnejšie určiť jej populačnú príslušnosť.

Pri aplikácii vyššie opísaných metód existujú určité obmedzenia. Pri ich použití teda nie je možné analyzovať syntézu cytokínov jednou bunkou, nie je možné určiť počet buniek produkujúcich cytokíny v subpopulácii, nie je možné určiť, či bunky produkujúce cytokíny exprimujú jedinečné markery, či rôzne cytokíny sú syntetizované rôznymi bunkami alebo rovnakými bunkami. Odpoveď na tieto otázky sa získava pomocou iných výskumných metód. Na stanovenie frekvencie buniek produkujúcich cytokíny v populácii sa používa metóda limitného riedenia a variant ELISPOT enzýmovej imunoanalýzy (pozri kapitolu 4).

In situ hybridizačná metóda. Metóda zahŕňa:

2) fixácia paraformaldehydom;

3) detekcia mRNA pomocou značenej cDNA. V niektorých prípadoch sa cytokínová mRNA stanovuje na rezoch pomocou rádioizotopovej PCR.

Imunofluorescencia. Metóda zahŕňa:

1) zmrazenie orgánu a príprava rezov z kryostatu;

2) fixácia;

3) ošetrenie rezov fluoresceínom značenými anti-cytokínovými protilátkami;

4) vizuálne pozorovanie fluorescencie.

Tieto techniky (hybridizácia in situ a imunofluorescencia) sú rýchle a nezávisia od prahových koncentrácií vylučovaného produktu. Neurčujú však množstvo vylučovaného cytokínu a môžu byť technicky zložité. Je potrebné rôzne starostlivé sledovanie nešpecifických reakcií.

Pomocou prezentovaných metód hodnotenia cytokínov boli identifikované patologické procesy spojené s poruchami v cytokínovom systéme na rôznych úrovniach.

Hodnotenie cytokínového systému je teda mimoriadne dôležité pre charakterizáciu stavu imunitného systému organizmu. Štúdium rôznych úrovní cytokínového systému umožňuje získať informácie o funkčnej aktivite rôznych typov imunokompetentných buniek, závažnosti zápalového procesu, jeho prechode na systémovú úroveň a prognóze ochorenia.

Otázky a úlohy

1. Zoznam všeobecné vlastnosti cytokíny.

2. Uveďte klasifikáciu cytokínov.

3. Uveďte hlavné zložky cytokínového systému.

4. Uveďte zoznam buniek produkujúcich cytokíny.

5. Opíšte rodiny cytokínových receptorov.

6. Aké sú mechanizmy fungovania cytokínovej siete?

7. Povedzte nám o produkcii cytokínov vo vrodenom imunitnom systéme.

8. Aké sú hlavné prístupy ku komplexnému hodnoteniu cytokínového systému?

9. Aké sú metódy testovania cytokínov v telesných tekutinách?

10. Aké sú defekty cytokínového systému pri rôznych patológiách?

11. Aké sú hlavné metódy biologického testovania IL-1, IFN, MIF, TNFa v biologických tekutinách?

12. Popíšte proces stanovenia intracelulárneho obsahu cytokínov.

13. Opíšte proces stanovenia cytokínov vylučovaných jednou bunkou.

14. Opíšte postupnosť metód používaných na detekciu defektu na úrovni cytokínového receptora.

15. Opíšte postupnosť metód používaných na detekciu defektu na úrovni buniek produkujúcich cytokíny.

16. Aké informácie možno získať štúdiom produkcie cytokínov v kultúre mononukleárnych buniek, v krvnom sére?